最近老師和同學經(jīng)常問針對外顯子測序的家系遺傳病如何進行突變篩選,今天小編就撰稿一篇,希望對老師和同學有所幫助,話不多說,直接看下面的干貨。
小編碎語：
DNA測序中從測序區(qū)域的大小分為全基因組重測序，全外顯子測序，靶向區(qū)域測序。全外顯子大概占DNA全部堿基對的1%，即大概30M的堿基，目前大部分測序的全外數(shù)據(jù)量為10G，測序深度大概為100X-150x左右，不同的試劑盒導致不同的捕獲效率的不同，不同試劑盒的均一度的不同導致不同區(qū)域?qū)嶋H深度不同，由于全外顯子測序檢測數(shù)據(jù)量適中(約10G)，與全基因組相比(約90G)，因為人類疾病有90%在外顯子區(qū)域,全外顯子測序十分具有性價比，可以發(fā)現(xiàn)與人類疾病關系密切的外顯子部分的相關基因突變。全外顯子的測序應用十分廣泛，整體從技術(shù)上來說，1)可以檢測 SNV 的 germ line 突變;2)也可以在一定程度上檢測腫瘤的 somatic 突變(深度200X以上);3)可以檢測外顯子區(qū)域的CNV, 融合等突變;從外顯子測序技術(shù)延伸出的臨床應用來說，可以應用于以下的方面：1)確定孟德爾遺傳疾病相關基因；2)風險易感基因的發(fā)現(xiàn)(與全基因組關聯(lián)分析類似);3)癌癥相關研究(高深度情況下);
全外顯子測序的高通量分析流程如下：
不同試劑盒導致捕獲效率的不同，不同試劑盒均一度的區(qū)別導致不同區(qū)域?qū)嶋H深度差異,下表為目前市場上主流試劑盒的比較。
孟德爾遺傳疾病相關研究(家系篩選)
通過全外顯子生物信息分析，通過初步將得到一些可能的致病突變;如果知道樣本家系屬于何種致病模式，可以使用不同的篩選模式進行篩選。篩選模式有：
1)常染色體隱性遺傳
甲、乙：隱性遺傳表現(xiàn)為雙親都沒病，孩子患病。
患病個體親代是突變攜帶者但表型正常，子代患病，如果不存在近親結(jié)婚或生殖隔離等因素，往往患者同一致病基因的不同位點存在致病突變，即患者帶有復合雜合突變（compound heterozygous mutations）。由于這類患者一般不多，可以對同胞患者及其正常雙親進行測序，分析時尋找子代復合雜合變異與雙親雜合變異共有的部分，從而發(fā)現(xiàn)致病位點。有時，僅對一對同胞對（sibpair）或一位患者進行測序即可發(fā)現(xiàn)常染色體隱性遺傳病致病基因。對于近親結(jié)婚或生殖隔離等因素導致的常染色體隱性遺傳病，患者致病基因往往存在純合突變，而患者的雙親往往是突變基因的雜合子。這時應當在搜尋在患者中呈純合狀態(tài)而在雙親中呈雜合狀態(tài)的變異。在這種情況下，患者雙親的親緣關系越遠，越有利于尋找致病位點。
建議選擇核心家系（如患病子代＋雙親，3~4例cases）；但是對于非近親結(jié)婚家系，盡量避免選取表型正常的同胞作為control，因為無法判斷個體是否攜帶致病突變，在后續(xù)分析中容易遺漏重要突變信息。
典型病例如白化病、苯丙酮尿癥、半乳糖血癥等。
2）常染色體顯性遺傳
丙、?。猴@性遺傳表現(xiàn)為雙親患病，孩子正常。
高通量測序技術(shù)用于顯性遺傳病致病基因搜尋的難度比較大，尤其對于常染色體顯性遺傳病。常染色體顯性遺傳病，致病基因的變異在雜合狀態(tài)下即可發(fā)病。常染色體雜合的變異往往很多，不容易縮小搜尋范圍。如果有相關基因的較精細的位置信息（例如小于2Mb的范圍）可以參考，則測定少數(shù)（甚至一個）患者即可確定致病位點。否則，則需要測定較多的患者。當確實需要對家系內(nèi)多個患者進行測序時，盡可能選擇親緣關系較遠的。也可以對家系中的患者和正常人進行測序，在數(shù)據(jù)分析時，在前者發(fā)現(xiàn)的雜合變異中，除去那些在后者中存在的雜合變異，余下的部分則包含致病變異。
測序建議選擇4個以上患病個體（通常稱為case）；或者選取至少2例患病個體（case）和1 例正常個體（通常稱為control）， case盡量選擇親緣關系較遠的樣本，control盡量選擇與其中一個患病個體親緣關系較近的樣本。
典型病例:如Waardenburg綜合征等。
3)新生突變分析
新生突變（de novo mutations，DNMs）是指父母的生殖細胞在減數(shù)分裂過程中發(fā)生并遺傳給下一代的突變，在多種散發(fā)性疾病，尤其是散發(fā)性神經(jīng)精神疾病中扮演著重要的角色?；诤诵募蚁档娜怙@子測序（whole-exome sequencing， WES）和全基因組測序（whole-genome sequencing， WGS）已經(jīng)成為鑒定DNMs最直接有效的方法。 因為新生突變模式是新發(fā)生的突變，即篩選父母中均不存在的突變卻在新生兒中存在的突變，著重對此突變進行相關的研究。
4)細胞質(zhì)遺傳(主要是線粒體病)
只要母親是患者，其后代都是患者；父親是患者，母親正常，其后代都正常。這是典型的母系遺傳特征，由此可知該病致病基因最可能位于細胞質(zhì)的線粒體基因中(下圖)。
高通量測序技術(shù)用于線粒體遺傳病的致病基因,可以直接篩選患病人種線粒體中的共同致病突變。線粒體基因組與核基因組在遺傳上的重要不同是：在一個細胞中，核基因組只有兩個拷貝，一個來自父親，一個來自母親；而線粒體基因組幾乎完全來自母親，并且有上千個拷貝（通常一個細胞有1000-2000個線粒體，一個線粒體有2-10個線粒體DNA拷貝）。這種拷貝數(shù)的不同也導致了在DNA突變檢測上的策略不同。對于基因組上某一位置的點突變只可能出現(xiàn)三種情況：均無突變，有一個拷貝發(fā)生突變，或者兩個拷貝均發(fā)生突變。而對于線粒體DNA來說，情況就要復雜的多，從一個線粒體DNA發(fā)生突變，到上千個線粒體DNA均發(fā)生突變，其中的突變頻率可以是0.1%~100%中的任何一個比例,這點在篩選過程中要尤其注意。
典型病例：如CPEO、KSS、MELAS、MERRF等。
5)伴Y遺傳
患者只有男性，男性患者的后代中，男性均患病，女性均正常，且代代相傳，即父傳子、子傳孫。由此可知該病致病基因最可能在Y染色體上(下圖)。
高通量測序技術(shù)用于伴Y遺傳，可以直接篩選Y染色體上的共同致病突變，相對來說比較簡單。典型病例如人類外耳道多毛癥、鴨蹼病、箭豬病等。
6)伴X隱性遺傳
伴X隱性遺傳病,具有以下明顯特征:1）具有隔代交叉遺傳現(xiàn)象；2）患者中男多女少；3）女患者的父親及兒子一定為患者，簡記為“女病，父子病”；4）正常男性的母親及女兒一定正常，簡記為“男正，母女正”；5）男患者的母親及女兒至少為攜帶者。
疾病呈X連鎖遺傳方式傳遞的家系也適于高通量測序分析。這類家系有利于縮小致病基因搜尋范圍，因為許多常染色體上的變異被排除了。譬如，對于X連鎖隱性遺傳病，可以對男性患者和及其母親（致病突變攜帶者）進行測序，尋找X染色體上case共有的純合變異,control中的雜合變異。然而，需要注意的是，有時X連鎖與常染色體隱性遺傳方式不易區(qū)分（當后者的家系中只有男性患者時），在進行相關的數(shù)據(jù)分析時需要注意。
典型病例:如人類紅綠色盲癥、血友病、果蠅的白眼遺傳、進行性肌營養(yǎng)不良、家族性遺傳性視神經(jīng)萎縮、眼白化病等。
7)伴X顯性遺傳
伴X顯性遺傳病,具有以下明顯特征:1)不管男女，只要存在致病基因就會發(fā)病，但因女子有兩條X染色體，故女子的發(fā)病率高于男子。因為沒有一條正常染色體的掩蓋作用，男子發(fā)病時，往往重于女子。2)病人的雙親中必有一人患同樣的病。3)可以連續(xù)幾代遺傳，但患者的正常子女不會有致病基因再傳給后代。4)男病人將此病傳給女兒，不傳給兒子，女病人（雜合體）將此病傳給半數(shù)的兒子和女兒(下圖)。尋找X染色體上case共有的雜合或者純合變異,control中的沒有變異的位點。
典型病例:抗維生素D佝僂病等。
8)散發(fā)樣本
要求的樣本數(shù)目比家系樣本要多一些。一般建議至少做30例(對于有些還需要100例以上)患病個體樣本以上的平行測序分析。對大量患病個體的測序數(shù)據(jù)進行分析，從而確定候選疾病相關變異，一般選取患者中共有的突變而case中不存在的突變,再用傳統(tǒng)一代測序測序在其他的相同疾病患病個體和正常人群中做進一步驗證。
全基因組關聯(lián)分析
如果我們在家系模式下,或者散發(fā)樣本模式下,仍舊沒有找到相關的突變,那么我們也可以試試采用全基因組關聯(lián)分析的分析方法,看能不能找到與疾病有關聯(lián)的突變位點。
全基因組關聯(lián)分析（Genome wide association study，GWAS）是對多個個體在全基因組范圍的遺傳變異（標記）多態(tài)性進行檢測，獲得基因型，進而將基因型與可觀測的性狀，即表型，進行群體水平的統(tǒng)計學分析，根據(jù)統(tǒng)計量或顯著性 p 值篩選出最有可能影響該性狀的遺傳變異（標記），挖掘與性狀變異相關的基因。
全基因組關聯(lián)分析可以采用plink軟件進行分析，模型采用:顯性模型(Dominant model)，隱形模型（Recessive model）和可加模型(Additive model),對風險位點和風險基因進行挖掘。全基因組關聯(lián)分析在只有少量表型數(shù)據(jù)的情況下,通常需要大量的樣本，需要上千個樣本,目前的研究有些達到了幾萬或者幾十萬的級別(在結(jié)合已知突變數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的情況下)。
