自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種以肝實(shí)質(zhì)損害為特征的炎癥性疾病，在亞太地區(qū)的發(fā)病率約為0.005%～0.025%，且呈逐年上升趨勢[1]，如果不及時(shí)治療，則會(huì)迅速發(fā)展為肝硬化和肝衰竭，嚴(yán)重危害人類健康。AIH的發(fā)病原因較為復(fù)雜，臨床上多以糖皮質(zhì)類激素如地塞米松磷酸鈉注射液等進(jìn)行治療，但極易引起機(jī)體諸多不良反應(yīng)[2]。因此，研究安全、有效和經(jīng)濟(jì)的治療藥物仍然是治療AIH的臨床需要。
荊防顆粒組方來源于明代張時(shí)徹《攝生眾妙方》中的荊防敗毒散，由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草11味中藥組成，具有暢達(dá)氣機(jī)，扶助正氣，消除風(fēng)寒、濕熱、痰瘀、氣滯的作用，廣泛用于多種系統(tǒng)疾病的治療[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，荊防顆粒具有良好的抗炎作用，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，保護(hù)肝臟的免疫功能[5-8]。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥物研究的新模式，通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病等相互作用網(wǎng)絡(luò)，對中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供新的方法[9-10]。本課題組前期研究表明，荊防顆粒對刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）誘導(dǎo)的免疫性肝炎具有顯著的保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度預(yù)測荊防顆粒治療AIH的成分、靶點(diǎn)和信號通路，結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證深入探究荊防顆粒對AIH的治療作用及作用機(jī)制，為臨床上應(yīng)用荊防顆粒治療AIH提供理論依據(jù)。
通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索荊防顆粒中的11味藥中所有的潛在靶點(diǎn)，以同時(shí)滿足OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，再通過UniProt數(shù)據(jù)庫更正和刪除重復(fù)項(xiàng)目后，共鑒定出269個(gè)與荊防顆粒相關(guān)的非重復(fù)性靶點(diǎn)和159個(gè)活性成分。將信息導(dǎo)入Cytoscape軟件分析荊防顆?！爸兴?成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，度值排名前10位的活性成分見表1。
通過Genecard、OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫共獲得761個(gè)AIH疾病相關(guān)靶點(diǎn)，匯總?cè)ブ睾?，共獲得343個(gè)非重復(fù)性靶點(diǎn)。將269個(gè)荊防顆粒靶基因與343個(gè)潛在AIH相關(guān)靶基因取交集，共獲得25個(gè)交集靶點(diǎn)（圖1-A），為荊防顆粒治療AIH的潛在靶點(diǎn)。應(yīng)用Cytoscape軟件對荊防顆粒治療AIH的25個(gè)潛在靶點(diǎn)構(gòu)建成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1-B。將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫得到PPI網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析獲得其核心網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape軟件可視化，見圖1-C。拓?fù)浞治銮?0名的核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)包括IL-6、TNF-α、IL-1β、STAT3、CXCL8、IL-10、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、Caspase-8（CASP8）和C反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）。
GO功能富集分析主要包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。將25個(gè)潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫后，得到GO條目689個(gè)（P＜0.01），生成了BP、MF、CC和KEGG富集分析結(jié)果。其中BP條目共646個(gè)，主要涉及細(xì)胞因子的產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)、凋亡信號通路和免疫過程；MF條目34個(gè)，主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合，包括腫瘤壞死因子受體結(jié)合；CC條目9個(gè)，主要涉及質(zhì)膜和囊泡（圖2）。KEGG通路富集分析篩選得到93條通路（P＜0.01），結(jié)果表明，荊防顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子、肝細(xì)胞壞死等信號通路治療AIH（圖3）。
通過建立Con A誘導(dǎo)的AIH小鼠模型，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果。如圖4-A所示，模型組小鼠死亡率遠(yuǎn)高于對照組，而各給藥組小鼠死亡率均低于模型組，且荊防顆粒中、高劑量組小鼠死亡率低于地塞米松組。如圖4-B、C所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT和AST活性均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，荊防顆粒中、高劑量組和地塞米松組血清中ALT和AST活性均顯著降低（P＜0.05、0.01）。如圖4-D所示，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的門脈炎癥，中央靜脈周圍出現(xiàn)嚴(yán)重的竇性充血以及點(diǎn)狀或斑片狀壞死；給予荊防顆?；虻厝姿闪姿徕c注射液治療后，小鼠肝臟中的炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死受到顯著抑制（P＜0.05、0.01）。以上結(jié)果表明，荊防顆?？梢詼p輕Con A誘導(dǎo)的AIH小鼠的肝損傷，且藥效優(yōu)于地塞米松磷酸鈉注射液。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果和KEGG通路富集分析表明，大多數(shù)確定的關(guān)鍵靶點(diǎn)在炎癥細(xì)胞因子的相互作用中富集。通過ELISA試劑盒檢測肝組織中相關(guān)炎癥因子水平，如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL8水平均顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組TNF-α水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒中、高劑量組和地塞米松組IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒高劑量組和地塞米松組IL-6水平顯著降低（P＜0.05），荊防顆粒中、高劑量組CXCL8水平顯著降低（P＜0.05），表明荊防顆粒對Con A誘導(dǎo)的AIH小鼠具有顯著的抗炎作用?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇荊防顆粒高劑量（8 g/kg）組作為代表組，探討荊防顆粒治療AIH的作用機(jī)制。
如圖6所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組小鼠肝組織中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和Bax蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。
如圖7所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1和下游IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），表明模型組小鼠具有明顯的炎癥反應(yīng)；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1和下游IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。
如圖8所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，荊防顆粒高劑量組TNF-α和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能夠抑制TNF-α/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平。
AIH是一種典型的自身免疫性疾病，發(fā)生于任何年齡和種族[12-13]。幾十年來對治療AIH藥物的研究表明，單一靶點(diǎn)藥物難以解決所有問題[14]。近年來，中醫(yī)藥治療AIH因其藥理作用明顯、不良反應(yīng)少而受到越來越多的關(guān)注[15]。荊防顆粒具有改善能量代謝循環(huán)、解表驅(qū)汗、抗炎等作用[3-5,8,16]。研究表明，荊防顆粒通過降低促炎因子表達(dá)、抗氧化、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad4信號通路對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化有明顯的治療作用[17]。此外，荊防顆粒還可以通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路發(fā)揮解酒保肝作用[18]。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合了中藥有效成分、相應(yīng)靶點(diǎn)和相應(yīng)疾病3個(gè)方面，并將其作為3種不同類型的節(jié)點(diǎn)，形成“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，揭示了中藥治療相關(guān)疾病的有效成分和作用機(jī)制[9]。李志杰等[19]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了苦黃顆粒治療AIH的活性成分和作用機(jī)制。郝建亨等[20]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究了丹參酮IIA治療AIH的潛在靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究荊防顆粒治療AIH的作用機(jī)制，確定了槲皮素是荊防顆粒最重要的活性成分，其次是木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚和漢黃芩素等。通過Venn圖確定荊防顆粒與AIH疾病相關(guān)的25個(gè)中心靶點(diǎn)。成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)表明，荊防顆粒在AIH治療中作用于多個(gè)靶點(diǎn)并產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。
GO功能和KEGG通路分析表明，大多數(shù)靶點(diǎn)在炎癥和凋亡過程中富集。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析未提供特定的信號通路靶點(diǎn)，但本研究從荊防顆粒治療AIH相關(guān)的交叉靶點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)了炎癥和凋亡通路。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示IL-6、TNF-α、IL-1β、STAT3和CXCL8是5個(gè)度值最大的靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)都表明了荊防顆粒對AIH的抗炎和抗凋亡特性，實(shí)際可能存在涉及更有效成分和作用機(jī)制的暗示。
Con A誘導(dǎo)的AIH模型是一種具有代表性的、易于構(gòu)建的AIH模擬模型，也是一種急性肝損傷模型，可導(dǎo)致高死亡率[21]。此外，Con A誘導(dǎo)的AIH模型的典型特征為炎癥細(xì)胞因子的分泌，ALT和AST活性升高，肝細(xì)胞凋亡和壞死異常[22]。本研究結(jié)果表明，荊防顆粒能顯著降低Con A誘導(dǎo)的AIH模型小鼠的死亡率、肝組織炎癥和細(xì)胞凋亡，并能抑制AIH小鼠血清ALT和AST的活性。
異常的IL-6/STAT3信號通路在AIH的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，抑制IL-6/SATA3信號通路可以減輕Con A誘導(dǎo)的肝損傷[23]。在自身免疫炎癥性疾病模型中，分泌的IL-6通過gp130與受體結(jié)合，激活JAK2并觸發(fā)STAT3通路，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡[24]。Bcl-2表達(dá)提高有利于增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡功能，而Bax的增加則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax/Bcl-2值通常用來表示細(xì)胞凋亡水平[25-26]。
李翔子等[27]研究結(jié)果證實(shí)，荊防顆?？梢酝ㄟ^抑制JAK2/STAT3通路調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，在蕁麻疹動(dòng)物模型中發(fā)揮抗炎作用，從而保護(hù)小鼠免受自身免疫性疾病。曹天佑等[28]研究證實(shí)，荊防顆?？娠@著抑制由炎癥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。IL-1β在多種自身炎癥性疾病中發(fā)揮重要的作用，IL-1β能夠通過支持T細(xì)胞存活、上調(diào)淋巴細(xì)胞上的IL-2受體、促進(jìn)B細(xì)胞增殖和Th17細(xì)胞分化來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[29]。NLRP3是先天免疫的重要組成部分，由NLRP3、ASC和Caspase-1組成，用于誘導(dǎo)IL-1β的釋放，在AIH肝臟炎癥中起關(guān)鍵作用[30]。
此外，IL-1β能與IL-6和TNF-α產(chǎn)生協(xié)同作用，參與炎癥細(xì)胞的釋放和炎癥通路的激活。TNF-α是一種炎癥細(xì)胞因子，可以激活固有免疫途徑并觸發(fā)炎癥反應(yīng)[31]。TNF-α通過介導(dǎo)NF-κB的激活來刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并增強(qiáng)AIH的炎癥反應(yīng)[32]。NF-κB是一種主要轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)Con A誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，并參與TNF-α誘導(dǎo)的不同類型細(xì)胞中炎癥蛋白的表達(dá)[33]。
El-Agamy等[34]闡明了NF-κB在Con A誘導(dǎo)的AIH發(fā)病機(jī)制中的作用，Con A刺激NF-κB的磷酸化并啟動(dòng)和調(diào)節(jié)炎癥過程，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明，荊防顆粒顯著抑制了AIH模型小鼠肝組織中STAT3、NLRP3和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。荊防顆粒可能通過抑制STAT3、NLRP3和NF-κB信號通路的激活，在細(xì)胞凋亡和炎癥水平上對AIH產(chǎn)生抑制作用。因此，STAT3、NLRP3和NF-κB信號通路是荊防顆粒治療AIH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
AIH早期發(fā)病原因主要為CD4+細(xì)胞活化和釋放IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF-α等多種細(xì)胞因子[35-37]。這些細(xì)胞因子在AIH中被誘導(dǎo)，并導(dǎo)致相關(guān)的有害免疫反應(yīng)[38]。而Con A誘導(dǎo)的AIH炎癥反應(yīng)主要由TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL8的增加介導(dǎo)[36-37,39-40]。ELISA和Western blotting結(jié)果表明，荊防顆粒顯著抑制STAT3、NLRP3和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白（IL-6、p-JAK2、p-STAT3、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、p-NF-κB p65）的表達(dá)，以上蛋白被激活后反過來刺激并調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL8的分泌。
本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和AIH小鼠模型，探究了荊防顆?？寡鬃饔脵C(jī)制。荊防顆粒通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用治療AIH，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果，為荊防顆粒治療AIH提供依據(jù)。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
參考文獻(xiàn)（略）
來 源：張永康，孫成宏，王西雙，姚景春，張貴民．基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討荊防顆粒對自身免疫性肝炎小鼠的治療作用及作用機(jī)制 [J]. 中草藥, 2023, 54(5):1461-1470.
