理化學(xué)研究所(理研)生命醫(yī)科學(xué)研究中心癌癥基因組研究小組高級(jí)研究員藤田征志(研究當(dāng)時(shí)，現(xiàn)客座研究員)、中川英刀小組組長(zhǎng)、巖手醫(yī)科大學(xué)醫(yī)齒藥綜合研究所醫(yī)療開發(fā)研究部門特任教授西冢哲等國(guó)際共同研究小組通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析[1]，明確了肝癌可以分為三類，找到了最適合每個(gè)肝癌的藥物療法。

本研究成果有望為肝癌的免疫療法、分子靶向藥物的選擇以及新治療藥物的開發(fā)做出貢獻(xiàn)。

此次，國(guó)際聯(lián)合研究小組對(duì)迄今為止在理研中進(jìn)行了全基因組序列分析[2]的259例肝癌，采用RPPA法[3]獲取功能性蛋白質(zhì)表達(dá)信息，綜合分析全基因組和RNA表達(dá)信息，進(jìn)行肝癌的功能性分子分類 ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以分為三組( R1、R2、R3 )，從理論上確定了各組的最佳藥物療法。 腫瘤免疫活動(dòng)較強(qiáng)的R1組采用免疫檢查點(diǎn)抑制劑[4]，預(yù)后最差、增殖能力強(qiáng)的R2組采用免疫檢查點(diǎn)抑制劑與血管生成抑制劑[5]復(fù)合免疫治療，一般認(rèn)為腫瘤免疫活動(dòng)弱的R3組適合用mTOR抑制劑[6]或RTK抑制劑[7]治療。本研究刊登在網(wǎng)絡(luò)科學(xué)雜志《Nature Communications》( 10月29日)上。

肝癌三種基于功能蛋白表達(dá)的分型( R1、R2、R3 )及最佳治療藥物

背景

肝癌在日本按部位分類的癌癥死亡人數(shù)中，男性排名第4，女性排名第6。 每年約有4萬(wàn)人被診斷為肝癌，2萬(wàn)7000多人( 2018年)死亡。注1 )。 主要原因是肝炎病毒的持續(xù)感染，全世界約75%的肝癌患者估計(jì)是乙型肝炎病毒( HBV )或丙型肝炎病毒( HCV )感染引起的，一旦感染肝炎病毒，從慢性肝炎發(fā)病經(jīng)過(guò)肝硬化后，肝癌發(fā)病的概率很高。現(xiàn)在有各種各樣的方法來(lái)治療肝癌。 外科切除、穿刺局部療法、肝動(dòng)脈化學(xué)栓塞療法、全身藥物療法、肝移植等，是在評(píng)價(jià)癌癥發(fā)展程度和肝臟功能的基礎(chǔ)上選擇的。 針對(duì)高度進(jìn)展期肝癌和復(fù)發(fā)性肝癌，推薦藥物療法，各種各樣的治療藥物正在被開發(fā)。 作為分子靶向藥物，以參與新生血管的形成的VEGF/VEGFR2[5]、與癌細(xì)胞的增殖相關(guān)的激酶(蛋白質(zhì)磷酸化酶) [8]為靶向的多激酶抑制劑( MKI ) [8]被廣泛使用，最近，免疫檢查點(diǎn)抑制劑和血管生成抑制劑的復(fù)合免疫療法被證實(shí)顯示出了很好的效果，被用作主要的治療方法。癌癥是由于基因組異常的積累而發(fā)病、發(fā)展的“基因組疾病”。 國(guó)際共同研究小組迄今為止，以肝炎病毒相關(guān)的肝癌為中心，通過(guò)基于全基因組序列分析注2 )的基因組變異、RNA序列分析，推進(jìn)了肝癌的腫瘤免疫注3 )的研究。 鑒定了各種各樣的基因組異常，闡明了基因組異?！つ[瘤免疫和肝癌發(fā)病的關(guān)系。 但是，在癌癥中發(fā)現(xiàn)的許多變異信息的意義仍然不明確，直接關(guān)系到肝癌的治療方針和新治療方法的開發(fā)的例子并不多。 其原因可能是，基因組是設(shè)計(jì)圖，而實(shí)際上對(duì)癌癥發(fā)生和增殖起作用的是蛋白質(zhì)，分子靶向治療藥物也是抑制激酶等蛋白質(zhì)功能的藥物。 因此，這次通過(guò)獲得癌癥的治療目標(biāo)和因癌癥而活化的功能蛋白質(zhì)的表達(dá)信息，或許可以與更合適的治療方針建立關(guān)聯(lián)，從而推進(jìn)了研究。

• 注1 )在國(guó)立癌癥研究中心癌癥信息服務(wù)中心“最新癌癥統(tǒng)計(jì)”新標(biāo)簽中打開注2 ) 2016年4月12日新聞發(fā)布會(huì)《解讀肝癌300例全基因組》 注3 ) 2020年2月28日新聞發(fā)布會(huì)《發(fā)現(xiàn)肝癌中的免疫抑制機(jī)制》

研究方法和成果

國(guó)際共同研究小組從至今為止在理研中進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析的日本人的300多例肝癌中，殘留的259例凍結(jié)標(biāo)本中提取蛋白質(zhì)，由美國(guó)MD安德森癌癥中心和巖手醫(yī)科大學(xué)的西冢哲特任教授等開發(fā)，通過(guò)高精度及再現(xiàn)性的包羅性蛋白質(zhì)測(cè)定方法RPPA法進(jìn)行了大規(guī)模蛋白質(zhì)分析(圖1左)。

以成為癌癥治療目標(biāo)的信號(hào)分子、激酶、激酶的磷酸化蛋白質(zhì)為主體，使用293個(gè)抗體制作了蛋白質(zhì)表達(dá)曲線。 RPPA法是迄今為止在美國(guó)大規(guī)模癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA[9]中采用的分析技術(shù)，擁有500例左右使用同一平臺(tái)的肝癌蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)也在此次分析中進(jìn)行了比較研究。 此外，我們還測(cè)量了承擔(dān)血管生成因子核心功能的磷酸化VEGFR2的量。 根據(jù)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析后，可以將這次日本人的肝癌分為三組( R1、R2、R3 ) (圖1右)。 從TCGA的肝癌數(shù)據(jù)中也確認(rèn)了同樣的3種分類，再現(xiàn)性也得到了證明。

圖1 RPPA法肝癌的分子分型及最佳治療藥物選擇

采用約300種抗體的RPPA法，建立肝癌功能蛋白表達(dá)圖譜，進(jìn)行三個(gè)分子分型( R1、R2、R3 )。 蛋白質(zhì)表達(dá)概況中紅色顯示高表達(dá)或激活，藍(lán)色顯示低表達(dá)或低活性。 右下是最適合各組的治療藥物選擇結(jié)果。 首先，R1群( 53例)多含有膽管分化型肝癌，免疫細(xì)胞瘤內(nèi)浸潤(rùn)也多，為免疫學(xué)熱點(diǎn)腫瘤[10] (圖2 )。 R2組( 100例)是細(xì)胞增殖功能高，含有很多預(yù)后不良的肝癌，細(xì)胞周期相關(guān)及血管新生相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)和活性高的腫瘤。 我們觀察到了很多抑癌基因TP53基因的變異，在免疫學(xué)上也是HOT腫瘤，另外VGFR2和磷酸化VGFR2的表達(dá)也有較高的趨勢(shì)(圖2 )。 并且，R3組( 106例)含有較多的免疫細(xì)胞瘤內(nèi)浸潤(rùn)少的免疫學(xué)COLD腫瘤[10]，觀察到較多的CTNNB1基因[11]變異。 有趣的是，R3群中含有大量非病毒肝癌，觀察到RTK/RAS/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]和TSC/mTOR信號(hào)[6]轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及激素相關(guān)和磷酸化蛋白的高表達(dá)(圖2 )。

圖2~3組腫瘤內(nèi)免疫、血管生成相關(guān)等功能蛋白的表達(dá)及活性

紅色表現(xiàn)為高表達(dá)或激活，藍(lán)色表現(xiàn)為低表達(dá)或低活性。 (上段)在免疫相關(guān)表達(dá)中，R1組和R2組高表達(dá)。 在(中段)血管新生中，R2組活化較高。 在(下段)功能分子、信號(hào)類別中，R3群中RTK、RAS/MAPK、TSC/mTOR信號(hào)活化。

然后，針對(duì)這三個(gè)分子分類群分別嘗試了最佳藥物治療的選擇。 因?yàn)镽1群在免疫學(xué)上是HOT的腫瘤，所以免疫檢查點(diǎn)抑制劑是首選。 除了免疫檢查點(diǎn)抑制劑外，R2組還建議使用對(duì)血管生成抑制作用的藥物、VEGF抑制抗體或VEGFR2有較強(qiáng)抑制作用的MKI治療。 而且，免疫COLD的R3群，由于TSC/mTOR及RTK和RAS/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，推薦使用mTOR抑制劑或RTK抑制劑，或者對(duì)它們有較強(qiáng)抑制作用的MKI。 實(shí)際上，對(duì)20種肝癌細(xì)胞株收集了同樣的RPPA法蛋白質(zhì)表達(dá)信息、基因變異信息、以及各種分子標(biāo)的敏感性(增殖抑制效果)的信息，證實(shí)了屬于R3群的肝癌細(xì)胞株對(duì)mTOR抑制劑的敏感性很高(圖3 )。

圖3 mTOR相關(guān)蛋白在肝癌細(xì)胞株的表達(dá)及mtor抑制劑的敏感性

• (左) TSC/mTOR相關(guān)蛋白在20種肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及CTNNB1基因的突變。 (右)顯示mTOR抑制劑濃度與細(xì)胞增殖抑制效果的關(guān)聯(lián)的圖表。 研究表明，屬于R3群的SNU398細(xì)胞株(藍(lán)線)對(duì)mTOR抑制劑的敏感性較高。

  
  

今后的期待 

根據(jù)本研究，可以進(jìn)行基于肝癌功能蛋白質(zhì)的分子分類。 針對(duì)高度惡化的肝癌和復(fù)發(fā)性肝癌，免疫療法和分子靶向藥物等各種各樣的治療藥物被開發(fā)出來(lái)，但可以期待通過(guò)這次的分類來(lái)恰當(dāng)?shù)剡x擇治療藥物。 另外，通過(guò)更加詳細(xì)地分析這些成為治療目標(biāo)的功能性蛋白質(zhì)信息，也可以期待對(duì)肝癌的新治療藥物的開發(fā)做出貢獻(xiàn)。

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補(bǔ)充說(shuō)明

蛋白質(zhì)組學(xué)分析 蛋白質(zhì)組學(xué)分析主要使用與特異性抗體的結(jié)合性、質(zhì)譜法、分析蛋白質(zhì)相互作用等技術(shù)，從而獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能性動(dòng)態(tài)等信息。 這些蛋白質(zhì)組學(xué)分析的成果與分子功能直接相關(guān)，因此可用于新醫(yī)藥品的有效開發(fā)和疾病機(jī)制的闡明等。 2 .全基因組序列分析 使用新一代序列發(fā)生器，解讀約30億堿基組成的個(gè)人正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的全部基因組信息，鑒定序列的差異和變化。 由于數(shù)據(jù)大量，一般使用超級(jí)計(jì)算機(jī)進(jìn)行信息分析。 全基因組序列分析時(shí)，不僅可以檢測(cè)編碼蛋白質(zhì)的1~2%范圍的外顯子，還可以檢測(cè)控制基因表達(dá)的基因組區(qū)域的變異和各種結(jié)構(gòu)異常(大的基因組序列異常)，可以說(shuō)是終極的基因組分析方法。 3.RPPA法 也稱為反相蛋白質(zhì)陣列法。 將組織和細(xì)胞提取液微陣列化(數(shù)千點(diǎn)/滑動(dòng))，使用蛋白質(zhì)和磷酸化特異性抗體，可以掌握數(shù)百~數(shù)千個(gè)試樣中約200~400個(gè)信號(hào)傳遞的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)和磷酸化狀態(tài)。 到目前為止，RPPA法已被美國(guó)最大規(guī)模的癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA采用，可以獲得精巧且重復(fù)性高的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)。 RPPA是Reverse Phase Protein Arrays的縮寫。 4 .免疫檢查點(diǎn)抑制劑 給予與抑制免疫反應(yīng)相關(guān)的PD-1、PD-L1特異性抗體，激活腫瘤免疫，發(fā)揮較好的抗腫瘤效果。 以PD-1為目標(biāo)的抗體藥，針對(duì)惡性黑色素瘤和肺癌，2014年在美國(guó)被批準(zhǔn)，2019年針對(duì)肝癌，也在日本被批準(zhǔn)。 而且，對(duì)于腎癌、胃癌、頭頸癌、食道癌等也已被批準(zhǔn)，對(duì)于惡化、復(fù)發(fā)肺癌和肝癌，逐漸成為首選藥物。 5 .血管生成抑制劑，VEGF/VEGFR2 肝癌、腎癌腫瘤內(nèi)血流十分豐富，增殖轉(zhuǎn)移時(shí)，稱為“血管新生”的營(yíng)養(yǎng)血管形成十分盛行。 血管生成抑制劑是指通過(guò)抑制血管生成不可缺少的因子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子( VEGF )與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體( VEGFR2)結(jié)合并活化，從而抑制新生血管的形成，使腫瘤內(nèi)血流正?；?作為血管生成抑制劑，抗VEGF抗體貝伐昔布被用于肝癌和大腸癌。 大多數(shù)多激酶抑制劑( MKI )也持有VEGFR2激酶的抑制效果，發(fā)揮血管新生抑制的效果。 6.mTOR抑制劑，TSC/mTOR信號(hào) mTOR (絲氨酸/蘇氨酸激酶)與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)、能量代謝、氧化還原狀態(tài)、細(xì)胞自噬等蛋白質(zhì)的合成降解等細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境，在細(xì)胞分裂和存活中起重要作用。 TSC是負(fù)責(zé)mTOR信號(hào)中心的抑癌基因。 阻礙mTOR的藥劑被開發(fā)出了很多，發(fā)揮免疫抑制和抗腫瘤活性。 目前，針對(duì)腎癌，苯甲醚和白紋菌素已被批準(zhǔn)。 7.RTK抑制劑、RTK/RAS/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 來(lái)自EGFR和HER2等受體酪氨酸激酶( RTK )的信號(hào)刺激，經(jīng)過(guò)RAS和RAF等多階段過(guò)程誘發(fā)MAPK (映射激酶)的活化，促進(jìn)細(xì)胞分裂。 此RTK/RAS/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路涉及許多磷酸化和激酶，包括RTK抑制劑(如EGFR抑制劑、HER2抑制劑等RTK抑制劑，以及BRAF抑制劑、MAPK抑制劑等各種抑制劑被用作癌癥的分子靶向藥物。8 .激酶(蛋白質(zhì)磷酸化酶)、多激酶抑制劑( MKI ) 激酶利用ATP大致分為磷酸化蛋白質(zhì)絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的絲氨酸/蘇氨酸激酶( STK )和磷酸化酪氨酸殘基的酪氨酸激酶( TK )。 人類存在500多種，負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 在癌細(xì)胞中，激酶的作用異常的情況很多，對(duì)其進(jìn)行抑制會(huì)抑制細(xì)胞增殖，因此成為抗癌劑的目標(biāo)。 多激酶抑制劑抑制癌細(xì)胞增殖和血管新生相關(guān)的血管生成因子受體VEGFR、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體( PDGFR )、干細(xì)胞因子受體( KIT )、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FDGFR、Raf等多種激酶，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制血管 對(duì)于肝癌，倫巴第、索拉非尼、瑞戈非尼得到認(rèn)可，各自阻礙的激酶不同。 9.TCGA 2006年開始在美國(guó)開展的大型癌癥基因組項(xiàng)目。 對(duì)20多種癌癥種類進(jìn)行了基因組RNA表達(dá)、DNA甲基化、蛋白質(zhì)表達(dá)異常的全面分析。 這些數(shù)據(jù)被廣泛公開，成為世界癌癥研究的重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。 MD安德森癌癥中心是TCGA蛋白質(zhì)表達(dá)分析的核心實(shí)驗(yàn)室，正在利用RPPA法進(jìn)行大規(guī)模分析。 TCGA是The Cancer Genome Atlas的縮寫。 10 .免疫學(xué)熱/冷腫瘤 在腫瘤組織內(nèi)，能觀察到很多識(shí)別并攻擊t細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞的腫瘤，在免疫學(xué)上被認(rèn)為是HOT。 在這個(gè)腫瘤中，通過(guò)免疫檢查點(diǎn)分子的活動(dòng)，免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的攻擊被抑制，免疫檢查點(diǎn)阻礙，腫瘤免疫被激活，腫瘤縮小。 相反，免疫學(xué)上COLD的腫瘤，因?yàn)楣裟[瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞不在腫瘤內(nèi)，所以沒有免疫檢查點(diǎn)阻礙的效果。 11.CTNNB1基因 編碼Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路核心分子β連環(huán)蛋白的基因。 β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。 在肝癌中，約30%觀察到CTNNB1基因變異，該變異激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)，也發(fā)揮腫瘤免疫抑制效果。

國(guó)際聯(lián)合研究組

理化研究所生命醫(yī)生科學(xué)研究中心癌癥基因組研究小組 高級(jí)研究員(研究時(shí)，現(xiàn)客座研究員)藤田征志

 研究員笹川翔太 隊(duì)長(zhǎng)中川英刀 巖手醫(yī)科大學(xué)醫(yī)齒藥綜合研究所醫(yī)療開發(fā)研究部門 特任教授西冢哲 廣島大學(xué)研究生院醫(yī)齒藥保健學(xué)研究院應(yīng)用生命科學(xué)部門消化系統(tǒng)代謝內(nèi)科學(xué) 助教大野淳 教授(研究當(dāng)時(shí))茶山一彰

  廣島大學(xué)醫(yī)院病理診斷科 教授有廣光司 和歌山縣立醫(yī)科大學(xué)第2外科 教授(研究當(dāng)時(shí))山上裕機(jī) MD安德森癌癥中心(美國(guó)) 研究生梅玉成( Mei-Ju May Chen ) 高級(jí)研究員多麗絲·里耶可西瓦克( Doris Rieko Siwak ) 韓廉教授

研究支援 

本研究得到文部科學(xué)省科學(xué)研究費(fèi)以及日本醫(yī)療研究開發(fā)機(jī)構(gòu)新一代癌癥醫(yī)療創(chuàng)生研究事業(yè)研究領(lǐng)域e“基于癌癥基因組分析的新型免疫療法及復(fù)合免疫療法開發(fā)的系列探索(研究代表者:中川英刀)”的資助。

原論文情報(bào)

• 藤田正史、陳美珠、桃瑞麗子·西瓦克、翔太·佐佐川、大澤綾子、辰口、有宏治、小野篤、米烏拉良一、前島和弘、相田寬、上野正樹、將鶴張楊信也、山崎宏、茶山和樹、李祖錫、魯羿伶、戈登·b·米爾斯、韓良、西冢聰和中川秀和，“病毒相關(guān)肝癌的蛋白基因組特征揭示潛在亞型和治療靶點(diǎn)”，《自然通訊》在新選項(xiàng)卡中打開
  

• Masashi Fujita, Mei-Ju May Chen, Doris Rieko Siwak, Shota Sasagawa, Ayako Oosawa-Tatsuguchi, Koji Arihiro, Atsushi Ono, Ryoichi Miura, Kazuhiro Maejima, Hiroshi Aikata, Masaki Ueno, Shinya Hayami, Hiroki Yamaue, Kazuaki Chayama, Ju-Seog Lee, Yiling Lu, Gordon B. Mills, Han Liang, Satoshi Nishizuka, and Hidewaki Nakagawa, "Proteogenomic Characterization of Virus-associated Liver Cancers Reveals Potential Subtypes and Therapeutic Targets", Nature Communications, 10.1038/s41467-022-34249-x

  

発表者

理化研究所 生命醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心癌癥基因組研究小組 高級(jí)研究員(研究時(shí)，現(xiàn)客座研究員)藤田征志 隊(duì)長(zhǎng)中川英刀 巖手醫(yī)科大學(xué)醫(yī)齒藥綜合研究所醫(yī)療開發(fā)研究部門 特任教授西冢哲

報(bào)道擔(dān)當(dāng)

理化研究所宣傳室新聞發(fā)言人 將在新選項(xiàng)卡中打開咨詢表單 巖手醫(yī)科大學(xué)法人事務(wù)部總務(wù)科宣傳系 Tel: 019-651-5111 (電話分機(jī): 5452 ) /傳真: 019-907-2448 email:kou Hou [ at ] j.Iwate-med.AC.jp ※請(qǐng)將※[at]替換為@。