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對(duì)黑色素瘤病人的T細(xì)胞免疫反應(yīng)研究顯示，效應(yīng)T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過抑制或者促進(jìn)的形式行使著不同的細(xì)胞功能，曾經(jīng)認(rèn)為這些腫瘤特異性T細(xì)胞共產(chǎn)生Th1/Th2，達(dá)到平衡的狀態(tài)。而越來(lái)越多的研究現(xiàn)實(shí)腫瘤特異性T細(xì)胞并非遵守Th1/Th2平衡理論，相反是一個(gè)多細(xì)胞因子參與的復(fù)雜免疫過程，因此該方案適用于T細(xì)胞亞群中的多種細(xì)胞因子檢測(cè)，比如過敏反應(yīng)中的細(xì)胞因子應(yīng)答特點(diǎn)，相對(duì)于傳統(tǒng)的微球法檢測(cè)培養(yǎng)液上清或者血漿中細(xì)胞因子，該方案能精準(zhǔn)判別該細(xì)胞因子的起源，準(zhǔn)確性更高，另外該方案也適用于細(xì)胞數(shù)目很少的標(biāo)本，比如腦脊液、穿刺液和腫瘤標(biāo)本等。

OMIP-008方案適用于人PBMC或者人源的一些T細(xì)胞系，通過體外刺激的方法檢測(cè)T細(xì)胞產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子。

如果該方案在CytoFLEX流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)研究，推薦的機(jī)型為CytoFLEX -S(B-R-V-Y)，相應(yīng)的產(chǎn)品信息可點(diǎn)擊文章末尾左下角的“閱讀原文”進(jìn)行了解。

如下圖，首先通過FSC參數(shù)的A和H去除細(xì)胞粘連體，然后利用CD3和CD14/CD19/ ViViD的散點(diǎn)圖圈出活的CD3+T細(xì)胞（CD3+ViViD- CD14- CD19-），考慮到染料的聚集導(dǎo)致的強(qiáng)陽(yáng)性顆粒形成，接下來(lái)去除掉熒光較強(qiáng)的顆粒，再次回到FSC和SSC的散點(diǎn)圖，圈住淋巴細(xì)胞，最后通過CD4和CD8圈出CD4+CD8-和CD4-CD8+的細(xì)胞群，待后面進(jìn)一步分析。

結(jié)果：

按照上述設(shè)門分析后，取CD4+CD8-細(xì)胞群分析其細(xì)胞因子表達(dá)情況如下：首先是圖B，取一個(gè)黑色素腫瘤病人的細(xì)胞系細(xì)胞，利用同種異體的黑色素腫瘤細(xì)胞系刺激，其IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-10和IL-2表達(dá)情況如下，相比未刺激組，其表達(dá)量顯著增高（數(shù)據(jù)未給出）；相反，C圖數(shù)據(jù)則顯示的是，研究一個(gè)黑色素腫瘤病人的細(xì)胞系細(xì)胞，利用自體黑色素腫瘤細(xì)胞系刺激后其IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-10和IL-2的表達(dá)情況。

1. 熒光素和抗體的搭配有什么規(guī)律，比如作者為什么選用PE熒光素去標(biāo)記IL-10？

答：總體說(shuō)來(lái)，熒光素和抗體的搭配遵循一個(gè)非常重要的原則，就是比較亮的熒光素搭配弱表達(dá)的抗原，比如PE就是非常亮的熒光素，在本方案中IL-10屬于胞內(nèi)細(xì)胞因子，本身表達(dá)非常弱，所以作者就將IL-10和PE搭配在了一起。

2. 為什么ViViD、CD14和CD19用的是同一個(gè)通道檢測(cè)？

答：因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)關(guān)注的是CD3+CD4+的Th細(xì)胞，不研究CD14陽(yáng)性的單核細(xì)胞以及CD19陽(yáng)性的B細(xì)胞，另外還需要排除死細(xì)胞帶來(lái)的非特異染色，所以作者巧妙的將這3個(gè)標(biāo)志物的熒光素放在流式的一個(gè)通道檢測(cè)，在儀器配置不夠高，熒光通道不夠的條件下，該方法可以增加有效檢測(cè)通道數(shù)量，用于研究其他標(biāo)志物的表達(dá)。

3. 該方案中的抗體，需要滴定嗎還是按說(shuō)明書直接加？

答：如果有條件，建議做抗體滴定實(shí)驗(yàn)，固定染色體積、細(xì)胞數(shù)以及染色條件后，將抗體做倍比稀釋，取信噪比（S/N）最高的點(diǎn)作為添加抗體量的佳點(diǎn)參考，下圖為作者做的抗體滴定實(shí)驗(yàn)，粉紅色矩形為抗體稀釋佳點(diǎn)。

4. 為什么使用PMA和Ionomycin等刺激劑刺激后，我的CD4細(xì)胞分群特別差，甚至無(wú)法分群，如果不刺激，分群卻很好？

答：因?yàn)镻BMC在PMA和Ionomycin刺激劑刺激后，其細(xì)胞膜表面的CD4抗原會(huì)內(nèi)陷，導(dǎo)致CD4分群相對(duì)未刺激樣本變差，文中作者試驗(yàn)了不同熒光素組合以及不同的克隆號(hào)，比如CD4分別用不同熒光素標(biāo)記，其中FITC, PE-Cy7, APC-H7,和 APC-Cy7標(biāo)記的抗體克隆號(hào)為RPA-T4，PerCP偶聯(lián)抗體克隆號(hào)為  L200  ，Pacific Orange 或者 QD605偶聯(lián)抗體克隆號(hào)為 S3.5 ，Ax700偶聯(lián)抗體克隆號(hào)為OKT4 donor PBMC ，如下圖，可以觀察出CD4抗原用克隆號(hào)RPA-T4熒光素為APC-CY7的組合標(biāo)記更佳，能明顯分群，因此大家可以作為參考借鑒。

5. 對(duì)于細(xì)胞因子檢測(cè)，陽(yáng)性和陰性經(jīng)常連續(xù)表達(dá)，無(wú)法設(shè)定陽(yáng)性門的界限，我該如何改進(jìn)？

答：這個(gè)時(shí)候我們往往需要設(shè)置對(duì)照，來(lái)幫助我們?cè)O(shè)定陽(yáng)性門的位置，可以使用未刺激對(duì)照，或者采用封閉對(duì)照來(lái)完成，比如檢測(cè)人IL-2，就在胞內(nèi)染色前，用純化的抗人IL-2抗體與細(xì)胞孵育，飽和后再用熒光素偶聯(lián)的IL-2抗體染色，如下圖粉色陽(yáng)性門。

6. 做細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)，必須要用新鮮血嗎，還是可以用隔夜的血？

答：作者在用Sphero? Rainbow Fluorescent Particles校準(zhǔn)好儀器的電壓和補(bǔ)償值后，取新鮮血，以及放在4°冰箱存放24h和48h后的血樣完成以上細(xì)胞因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Ax488 熒光素對(duì)應(yīng)的IL-4和QD605對(duì)應(yīng)的CD8，熒光強(qiáng)度略有降低，但并不影響后續(xù)的畫門以及造成細(xì)胞因子陽(yáng)性的百分比結(jié)果巨大改變。

Zuleger CL, Albertini MR. OMIP-008: measurement of Th1 and Th2 cytokine polyfunctionality of human T cells. Cytometry A. 2012 Jun;81(6):450-2. doi: 10.1002/cyto.a.22035. PMID: 22431369

*本文由貝克曼庫(kù)爾特公司流式技術(shù)支持吳永強(qiáng)供稿。文中所提及產(chǎn)品（CytoFLEX）僅用于科研，不用于臨床診斷。