一、探討核酸與蛋白的相互作用
電泳遷移率轉(zhuǎn)移法(EMSA)是一種檢測核酸蛋白復(fù)合物特異性結(jié)合的有效方法。
在過去的30年里，EMSA一直是研究核酸(DNA或RNA)與核酸結(jié)合蛋白之間定性相互作用的“檢測手段”。
通過使用放射性標(biāo)記探針，可以比較信號在聚丙烯酰胺凝膠上的位置，從而確定定性的相互作用。
此外，隨著計算機(jī)和光學(xué)成像技術(shù)的新進(jìn)展，EMSA已經(jīng)從單純的定性分析轉(zhuǎn)變?yōu)槎糠治觥?/span>
二、加深對EMSA的理解
凝膠電泳是一種常用的根據(jù)分子量分離一組核酸或蛋白質(zhì)的方法。
通常，瓊脂糖凝膠用于運(yùn)行核酸，聚丙烯酰胺凝膠常用于蛋白質(zhì)的分離。
EMSA利用了凝膠電泳中，在電場均勻的情況下，大型核酸蛋白復(fù)合物的遷移速度要比單一蛋白慢得多(如下圖)。
為了解釋這一點(diǎn)，我們來看看蛋白質(zhì)的遷移。假設(shè)蛋白質(zhì)x是一個基本單位(單體)，它能夠與其他蛋白質(zhì)x結(jié)合形成一個更大的復(fù)合物，稱為四聚體。
在相同電場下，四聚體在凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中總是比單體運(yùn)行得慢得多。
第1道:陰性對照(DNA)，第2道:蛋白質(zhì)+不結(jié)合的DNA，第3道:陽性對照。
如果將同樣的原理應(yīng)用于DNA結(jié)合蛋白，如果存在特定的DNA -蛋白復(fù)合物，那么凝膠電泳后的帶遷移將發(fā)生變化。
DNA-蛋白復(fù)合物的帶遷移通常用放射性標(biāo)記的DNA探針來檢測序列特異性相互作用，這些探測通常由正在檢測的結(jié)合序列的線性延伸組成。
可以選擇在線性探針的前端(5 ')或后部(3 ')-端標(biāo)記放射性同位素，如磷酸鹽-32 (32P)。
電泳后，凝膠通過x射線膠片顯示出來。
為了更加確定特定的蛋白是否與DNA結(jié)合，研究人員還可以在復(fù)合物中添加針對核酸結(jié)合蛋白的單克隆抗體，導(dǎo)致“凝膠超移位”。
研究蛋白質(zhì)- DNA相互作用有多種方法。
例如，如果你想描述DNA-蛋白復(fù)合物的特征，可以使用免疫沉淀(或DNA下拉)，這涉及到使用帶有磁珠標(biāo)記的抗體。
樣品可以通過磁性柱純化(下拉)。
此外，一種更專業(yè)的染色質(zhì)免疫沉淀分析(ChIP)有時可以代替EMSA。
三、核酸-蛋白質(zhì)檢測方法的進(jìn)階歷程
===檢測方法的類型===
01
放射性探針與熒光染料探針
如上所述，傳統(tǒng)的EMSA檢測是使用放射性標(biāo)記的核酸探針。
雖然凝膠轉(zhuǎn)移法的原理沒有改變，新的檢測試劑不斷開發(fā)。
現(xiàn)在，我們需要遠(yuǎn)離可能傷害我們自己和污染我們環(huán)境的放射性物質(zhì)。
可替代的，研究人員使用熒光染料或熒光素發(fā)光系統(tǒng)，這些新系統(tǒng)不僅在健康和環(huán)境方面更安全，而且比放射性裝置更精確，往往產(chǎn)生更少的背景噪音。
要使用熒光探針，需要一種具有激發(fā)光源的光學(xué)圖像采集系統(tǒng)。
通常，這些成像設(shè)備由兩部分組成：
1)控制圖像聚焦和曝光的數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng);
2)廣譜光源(從紫外線到不同激發(fā)波長的激光器)，以配合市場上不同種類的熒光染料。
采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，可以獲得良好的成像效果。
02
化學(xué)發(fā)光EMSA
通常，這類試劑盒提供生物素標(biāo)記的受控DNA和核提取控制設(shè)備，供您標(biāo)準(zhǔn)化您的實(shí)驗(yàn)。
使用合適的檢測設(shè)備，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)會發(fā)出清晰而強(qiáng)烈的信號。
輕微的缺點(diǎn)是，需要對DNA模板(目標(biāo))進(jìn)行生物素化，但通常也可以從商業(yè)來源定制DNA寡核苷酸。
03
SYBR綠色核染色&紅色蛋白染色
一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功地使用了EMSA的商用試劑盒，這些試劑盒被設(shè)計用來根據(jù)顏色分離核酸和蛋白質(zhì)。
核酸染成綠色，蛋白質(zhì)染成紅色。因此，當(dāng)兩者形成復(fù)合物時，最終顏色將是黃色。
同樣，可以在商業(yè)光學(xué)成像系統(tǒng)上可視化您的結(jié)果。
這是一種非常簡潔的快速檢測方法，特別是當(dāng)標(biāo)記目標(biāo)核酸不是最佳選擇時。
===檢測的其它方法===
01
快速瓊脂糖凝膠電泳
由Lewis KA領(lǐng)導(dǎo)的一個研究小組開發(fā)了一種使用瓊脂糖凝膠的新方法。
該方法比傳統(tǒng)SDS-PAGE使用的聚丙烯酰胺更容易制備和表現(xiàn)。
此外，該組能夠通過在高電壓下運(yùn)行來減少運(yùn)行時間并仍然獲得高分辨率數(shù)據(jù)。
但通常，增加電壓可能導(dǎo)致拖尾效應(yīng)。
02
微流體與96孔板微陣列
還有一些更專業(yè)的檢測方法。
例如，NF-kB檢測試劑盒使用固定的靶序列DNA進(jìn)行高通量篩選。
它適用于96孔板形式，可以添加樣品核提取物，使用能夠檢測核DNA復(fù)合物的單克隆抗體檢測陽性結(jié)果。
另一種潛在的高通量方法使用微流體芯片，設(shè)計用于分離不同大小的DNA片段。
由Smith等人領(lǐng)導(dǎo)的研究小組報道，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物也可以使用這些微流體裝置分離。
EMSA在DNA-蛋白質(zhì)相互作用方面具有廣泛的應(yīng)用，并且仍在添加和修改不同的檢測方法。
