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最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺死所有的微生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。

培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。

菌落（colony）：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體，稱為菌落。

菌苔（lawn）：當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔。

大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌以及許多真菌和單細(xì)胞藻類都能很方便地通過平板分離法獲得純培養(yǎng)。

                                  各種微生物形成的菌落特征

目前實(shí)驗(yàn)室用固體培養(yǎng)基獲得微生物純培養(yǎng)的幾種常用方法：

• 1.涂布平板法（spread plate method）

• 2.稀釋倒平板法（pour plate method）

先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋(如1:10、1:100、1:1000、1:10000…)，然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)微生物細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。

• 3.平板劃線法

                                                 平板劃線法

• 4.稀釋搖管法（shake tube method）
  

用固體培養(yǎng)基分離嚴(yán)格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后放置在封閉的容器中培養(yǎng)，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋播管培養(yǎng)法進(jìn)行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱，使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋，試管迅速搖動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進(jìn)行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟-石蠟蓋取出，再用一只毛細(xì)管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進(jìn)行觀察和菌落的移植。

用液體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)

對于大多數(shù)細(xì)菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因?yàn)樗鼈兊拇蠖鄶?shù)種類在固體培養(yǎng)基上長得很好。然而并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，例如，一些個(gè)體大的細(xì)菌、許多原生動(dòng)物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。

通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的概率就會(huì)急劇下降。因此，采用液體培養(yǎng)基稀釋法，同一個(gè)稀釋度應(yīng)有較多的平行試管，而有可能獲得純培養(yǎng)的那個(gè)稀釋度的大多數(shù)試管(一般應(yīng)超過95%)應(yīng)表現(xiàn)為沒有細(xì)菌生長。

單細(xì)胞（孢子）分離

稀釋法有一個(gè)重要缺點(diǎn)，它只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量優(yōu)勢的種類，而在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時(shí)，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)稱為單細(xì)胞(或單孢子)分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的細(xì)菌則較難。

對于較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。

選擇培養(yǎng)

要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法，或抑制大多數(shù)其他微生物的發(fā)展，或造成有利于該菌生長的環(huán)境，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后使該菌在菌群中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進(jìn)行純培養(yǎng)分離。

選擇平板培養(yǎng)——比如：要分離高溫菌，可在高溫條件進(jìn)行培養(yǎng)。

富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)主要是指利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，使人們能夠更容易地從自然界中分離到這種所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點(diǎn)從物理、化學(xué)、生物及綜合多個(gè)方面進(jìn)行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養(yǎng)等方面。

如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識地保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。

微生物的保藏技術(shù)

• 傳代培養(yǎng)保藏

常用的有瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)等。采用傳代法保藏微生物應(yīng)注意針對不同的菌種而選擇適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行移種，以免由于菌株接種后不生長或超過時(shí)間不能接活，喪失微生物菌種。在瓊脂斜面上保藏微生物的時(shí)間因菌種的不同而有較大差異，有些可保存數(shù)年，而有些僅數(shù)周。一般來說，通過降低培養(yǎng)物的代謝或防止培養(yǎng)基干燥，可延長傳代保藏的保存時(shí)間。例如，在菌株生長良好后，改用橡皮塞封口或在培養(yǎng)基表面覆蓋液體石蠟，并放置低溫保存；將一些菌的菌苔直接刮入蒸餾水或其他緩沖液后，密封置4℃保存，也可以大大提高某些菌的保藏時(shí)間及保藏效果，這種方法有時(shí)也被稱為懸液保藏法。

• 冷凍保藏

將微生物處于冷凍狀態(tài)使其代謝作用停止，可達(dá)到保藏的目的。大多數(shù)微生物都能通過冷凍進(jìn)行存，細(xì)胞體積大的要比小的對低溫更敏感，而無細(xì)胞壁的則比有細(xì)胞壁的敏感。其原因與低溫會(huì)使細(xì)內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞，尤其是細(xì)胞膜的損傷。進(jìn)行冷凍時(shí)，適當(dāng)采取速凍的方法，可因產(chǎn)生的冰晶小而減少對細(xì)胞的損傷。當(dāng)從低溫下移出并開始升溫時(shí)，冰晶又會(huì)長大，故快速升溫可減少對細(xì)胞的損傷。冷凍時(shí)的介質(zhì)對細(xì)胞的損傷也有顯著的影響。例如0.5m0/L左右的甘油或二甲亞楓可透入細(xì)胞，并通過降低強(qiáng)烈的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞；大分子物質(zhì)如糊精、血清蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)雖不能透入細(xì)胞但可通過與細(xì)胞表面結(jié)合的方式而防止細(xì)胞膜凍傷。因此在采用冷凍法保藏菌種時(shí)，一般應(yīng)加入各種保護(hù)劑以提高培養(yǎng)物的存活率。

一般來說，保藏溫度越低，保藏效果越好。在常用氮保藏可達(dá)到-196℃。

• 干燥保藏法

沙土管保存和冷凍真空保藏是最常用的兩項(xiàng)微生物干燥保藏技術(shù)。

前者主要適用于產(chǎn)包子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等。如芽孢桿菌、放線菌等。一般將菌種接種斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液加入無菌的沙土管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法簡便易行，并可以將微生物保藏較長時(shí)間，適合一般實(shí)驗(yàn)室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。冷凍真空保藏是將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過冰的升華作用除去水分。達(dá)到干燥的樣品可在真空或情性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動(dòng)處于休眠，可以達(dá)到長期保藏的目的。用冰升華的方式除去水分，手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果均不錯(cuò)，而且經(jīng)抽真空封閉的菌種安瓿管的保存、郵寄、使用均很方便。因此冷凍真空干燥保藏是目前使用最普遍、最重要的微生物保藏方法，大多數(shù)專業(yè)的菌種保藏機(jī)構(gòu)均采用此法作為主要的微生物保存手段。

除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方法還有很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物適宜。

微生物類群龐雜，種類繁多，包括細(xì)胞型和非細(xì)胞型兩類。

細(xì)菌的形態(tài)和排列

基本形態(tài)可分為：球狀、桿狀與螺旋狀3種。

細(xì)菌的3種基本形態(tài)（左為模式圖，右為照片）

支原體由于只有細(xì)胞膜，沒有細(xì)胞壁，故細(xì)胞柔軟，形態(tài)多變，具有高度多形性。

根據(jù)菌絲的形態(tài)和功能又可分為營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲3種，其中孢子絲的形態(tài)特征是放線菌的重要鑒定指標(biāo)。

一般處于幼齡階段和生長條件適宜時(shí)，細(xì)菌形態(tài)正常、整齊，表現(xiàn)出特定的形態(tài)。在較老的培養(yǎng)物中，或不正常的條件下，細(xì)胞常出現(xiàn)不正常形態(tài)，尤其是桿菌，有的細(xì)胞膨大，有的出現(xiàn)梨形，有的產(chǎn)生分支，有時(shí)菌體顯著伸長以至呈絲狀等。這些不規(guī)則的形態(tài)統(tǒng)稱為異常形態(tài)，若將它們轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中或適宜的培養(yǎng)條件下又可恢復(fù)原來的形態(tài)。

不同細(xì)菌大小的比較

除少數(shù)例外，一般幼齡細(xì)菌比成熟的或老齡的細(xì)菌大得多。

培養(yǎng)基中滲透壓增加也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變小。

一般細(xì)菌的直徑通常都在1μm以上。

真菌

霉菌、酵母菌以及大型真菌如蘑菇等皆為真菌，均屬真核微生物。

霉菌

霉菌（mold）是一些“絲狀真菌”的統(tǒng)稱，不是分類學(xué)上的名詞。霉菌菌體均由分支或不分支的菌絲（hypha）構(gòu)成。

菌絲直徑約為2——10μm

霉菌菌絲有兩類:

1. 無隔膜菌絲

2. 有隔膜菌絲

霉菌菌絲示意圖

酵母菌

酵母菌（yeast）是一群單細(xì)胞的真核微生物。

大多數(shù)酵母菌為單細(xì)胞，一般呈卵圓形、圓形、圓柱形或檸檬形。

有些酵母菌細(xì)胞與其子代細(xì)胞連在一起成為鏈狀，稱為假絲酵母。

藻類

藻類( algae)是指除苔蘚植物和維管束植物以外，基本上有葉綠素，可進(jìn)行光合作用，并伴隨放出氧氣的一大類真核生物，它們大多屬于只有通過顯微鏡才能觀察到個(gè)體形態(tài)的微生物。但也有一些藻類個(gè)體很大，如大的海藻可長達(dá)若干米。

原生動(dòng)物( prokaryote)是一類缺少真正細(xì)胞壁，細(xì)胞通常無色，具有運(yùn)動(dòng)能力，并進(jìn)行吞噬營養(yǎng)的單細(xì)胞真核生物。