活體生物發(fā)光成像技術(shù)的最新進(jìn)展-實驗-生物谷
http://www.bioon.com/experiment/image4/167670.shtml活體動物體內(nèi)光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動物
實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。另外, 這一技術(shù)對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。 因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點, 在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。
一、 技術(shù)原理
1. 標(biāo)記原理
哺乳動物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。對于細(xì)菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的
基因組成，帶有這種操縱子的細(xì)菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。
基因、細(xì)胞和活體動物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過分子生物學(xué)克隆技術(shù), 將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的
細(xì)胞株。目前, 常用的
細(xì)胞株基本上都已標(biāo)記好, 市場上已有銷售。 將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后, 觀測前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個光子，這是肉眼無法觀察到的，精諾真公司（Xenogen Corp.）生產(chǎn)的IVIS成像系統(tǒng)，應(yīng)用一個高度靈敏的制冷CCD相機及特別設(shè)計的成像暗箱和成像
軟件，可觀測并記錄到這些光子。
2. 光學(xué)原理
光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用精諾真公司的IVIS系統(tǒng)最少可以看到皮下的500個細(xì)胞，當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細(xì)胞數(shù)是不同的。在相同的深度情況下, 檢測到的發(fā)光強度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系?？梢姽怏w內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實驗動物的組織并且可由儀器量化檢測到的光強度，同時反映出細(xì)胞的數(shù)量。
3. 實驗過程
通過分子生物學(xué)克隆技術(shù), 應(yīng)用單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶蛋白的
細(xì)胞株。
典型的成像過程是：小鼠經(jīng)過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺，
軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動關(guān)閉照明燈, 在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。 與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進(jìn)行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實驗數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強大，可以加快實驗速度，方便大批量的實驗。
4．熒光成像功能
精諾真活體動物成像系統(tǒng)IVIS200具有內(nèi)置熒光成像功能。 熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報告基團，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優(yōu)點。 同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測生理指標(biāo)的最佳選擇。
Xenogen的IVIS系統(tǒng)可檢測波長范圍400–950nm的熒光，通過六塊不同的激發(fā)光濾鏡獲得所需的特定激發(fā)光波長。光線通過第二塊藍(lán)色漂移背景光濾鏡（blue-shifted background filters），使得初始的激發(fā)光產(chǎn)生輕微的藍(lán)色漂移。以不同波長的激發(fā)光，在不激發(fā)熒光報告基團時激發(fā)組織的自發(fā)熒光，從而將靶信號與背景光區(qū)分開，消除自發(fā)熒光。
雖然熒光信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)強于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來研究活體動物體內(nèi)成像。 但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標(biāo)記靶點多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法。最近許多文獻(xiàn)報道的實驗中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對細(xì)胞或動物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究；然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動物體內(nèi)檢測， 進(jìn)行活體動物體內(nèi)研究。
二、 技術(shù)應(yīng)用
通過活體動物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測到疾病或癌癥的發(fā)展進(jìn)程以及藥物治療所產(chǎn)生的反應(yīng)，并可用于病毒學(xué)研究、構(gòu)建
轉(zhuǎn)基因動物模型、
siRNA研究、干細(xì)胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細(xì)胞體外檢測等領(lǐng)域。具體應(yīng)用如下：
1. 標(biāo)記細(xì)胞
（1） 癌癥與抗癌藥物研究
直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可對癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實時觀測和評估。活體生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。精諾真生物成像技術(shù)提高了檢測的靈敏度，即使微小的轉(zhuǎn)移灶也能被檢測到（可以檢測到體內(nèi)102個細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移）。目前已商品化的腫瘤細(xì)胞株包括：前列腺癌,黑色素瘤，
乳腺癌，肺癌，子宮頸癌和結(jié)腸癌等 BiowareTM細(xì)胞系模型。
以下是美國科學(xué)院院士John Massague(美國斯隆-凱特琳癌癥紀(jì)念醫(yī)院/霍華德.休斯醫(yī)學(xué)研究所)應(yīng)用本技術(shù)進(jìn)行乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)基因研究的文獻(xiàn)：
Genes that mediate breast cancer metastasis to lung
NATURE, July 2005, Vol 436
（2） 免疫學(xué)與干細(xì)胞研究
將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可用于實時觀測活體動物體內(nèi)干細(xì)胞造血過程的早期事件及動力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞，檢測放射及化學(xué)藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機制。應(yīng)用可見光活體成像原理標(biāo)記細(xì)胞，建立動物模型，可有效的針對同一組動物進(jìn)行連續(xù)的觀察，節(jié)約動物樣品數(shù)，同時能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達(dá)的改變。
（3）
細(xì)胞凋亡當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性，細(xì)胞不能發(fā)光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase-3在特異識別位點切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。
2. 標(biāo)記病毒
（1） 病毒侵染
以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對機體的侵染過程。
（2） 基因治療
基因治療包括在體內(nèi)將一個或多個感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到靶細(xì)胞。可應(yīng)用熒光素酶基因作為報告基因用于
載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否能夠在試驗動物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達(dá)。這種非侵入方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中, 用來觀察脂質(zhì)體為
載體的DNA運輸和基因治療情況。
以下為運用該技術(shù)進(jìn)行Herpesvirus saimiri病毒作為肝臟疾病基因治療
載體的可行性研究的文獻(xiàn)：
Herpesvirus saimiri-based vector biodistribution using noninvasive optical imaging
Gene Therapy (2005) 12, 1465–1476
3. 標(biāo)記細(xì)菌
（1） 細(xì)菌侵染研究
可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌侵染活體動物, 觀測其在動物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應(yīng)。
（2） 抗生素藥物
利用標(biāo)記好的細(xì)菌在動物體內(nèi)對藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機構(gòu)可用這種成像技術(shù)進(jìn)行藥物篩選和臨床前動物實驗研究。近年來，國際上大型
制藥公司紛紛將精諾真技術(shù)在動物體內(nèi)的實驗結(jié)果作為ＦDA(美國食品和藥品檢驗局)藥物申報材料中非常重要的臨床前動物實驗部分。
4. 基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用
（1） 組織特異性基因表達(dá)
熒光素酶(luciferase)是一類生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識別不同的底物, 一種細(xì)胞可被這兩種熒光素酶標(biāo)記: renilla 熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動子驅(qū)動, 作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化; firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達(dá)活性。
（2） 蛋白質(zhì)相互作用
觀察細(xì)胞中或活體動物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導(dǎo)入細(xì)胞或動物體內(nèi)表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強相互作用時，表達(dá)的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑。
（3） 阻斷RNA
通過對比生物發(fā)光的變化，驗證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達(dá)。
5.
轉(zhuǎn)基因動物模型
（1） 基因表達(dá)
為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況，從而實現(xiàn)對目的基因的研究。可用于研究動物發(fā)育過程中特定基因的時空表達(dá)情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)，以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。
（2） 各種疾病模型
研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記，同時轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在體內(nèi)的實時表達(dá)和對候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)，還可以用來評估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。
問答小分子藥物的標(biāo)記用熒光與PET，哪一個更好？
小分子可以用熒光，也可以用放射性同位素標(biāo)記進(jìn)行相關(guān)的實驗。但是由于熒光機團的大小與小分子藥物差不多，用之標(biāo)記小分子后，會影響小分子藥物的特性，尤其是吸收、代謝方面。所以熒光標(biāo)記小分子只是在不具備PET的使用條件后的一個替代方法，并不是最合適的方法。國外一般都是用PET標(biāo)記小分子藥物進(jìn)行相關(guān)的研究。
為什么小動物CT不適合做腫瘤學(xué)研究？生物發(fā)光成像和小動物CT比較，有什么優(yōu)勢？小動物CT適合做結(jié)構(gòu)成像，對所觀察標(biāo)的的密度變化的敏感性很好，但是對于腫瘤細(xì)胞的活躍程度不敏感，如2005年1月JCI的一篇關(guān)于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的文章里，詳細(xì)比較了小動物CT與生物發(fā)光成像在觀察骨轉(zhuǎn)移方面靈敏度的不同。小動物CT要在接種16天以后，發(fā)生骨壞死，有溶骨現(xiàn)象，才能夠觀察到骨轉(zhuǎn)移的存在，而生物發(fā)光成像在接種后第一天就觀察到了骨轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。
體內(nèi)可見光技術(shù)的發(fā)展過程是怎樣的？研究人員在1995年對此技術(shù)開始研究，技術(shù)在1999年才開始成熟，精諾真的商業(yè)產(chǎn)品在2000年出現(xiàn)在市場上。但大量的研究工作是在最近兩年才開始的。技術(shù)開始流行起來，多數(shù)的文章也是在最近兩年發(fā)表的。國內(nèi)已經(jīng)有四家單位購買了該系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)的研究，有很多的科研工作者對這項技術(shù)產(chǎn)生了濃厚的興趣，越來越多的人開始計劃用該技術(shù)進(jìn)行腫瘤學(xué)、流行病學(xué)、藥物研究等。
相對于傳統(tǒng)技術(shù)，生物發(fā)光成像技術(shù)的優(yōu)勢研究領(lǐng)域在哪里？沒有優(yōu)勢的領(lǐng)域在哪里？該技術(shù)是一項在某些領(lǐng)域有很大不可替代優(yōu)勢的技術(shù)，但是并不是萬能的技術(shù)。因此，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，有它特別適合的領(lǐng)域，也有它不適合的領(lǐng)域。腫瘤轉(zhuǎn)移研究，基因治療，流行病學(xué)的發(fā)病學(xué)研究，干細(xì)胞示蹤，
白血病的相關(guān)研究等是該技術(shù)非常有優(yōu)勢的領(lǐng)域。在藥物開發(fā)方面，用該技術(shù)進(jìn)行腫瘤的藥效研究，比傳統(tǒng)方法更靈敏，還可以通過一系列轉(zhuǎn)基因疾病動物模型，來快速直觀的進(jìn)行相關(guān)疾病的發(fā)病機理和藥物篩選研究。
細(xì)胞凋亡的研究PNAS(美國科學(xué)院院報)上發(fā)表的一篇文章介紹，可利用精諾真體內(nèi)可見光成像技術(shù)直接觀察活體動物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡。具體方法是：用分子生物學(xué)方法在熒光酶的兩端連接上抑制其發(fā)光的蛋白(如雌激素)，但在其連接處加上CASPASE(細(xì)胞凋亡時特異表達(dá)的一種酶)的酶切點。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，表達(dá)CASPASE，切開抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，使熒光酶開始發(fā)光。
蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的關(guān)系，如何研究？PNAS(美國科學(xué)院院報)上發(fā)表的一篇文章介紹，可利用精諾真體內(nèi)可見光成像技術(shù)研究活體動物體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用。具體方法是：將分開時都不單獨發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個不同的蛋白質(zhì)上，若是這兩個蛋白質(zhì)之間有相互作用,，熒光酶的C端和N端就會被帶到一起, 產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象.。詳細(xì)內(nèi)容見文章。
成體小鼠可以看到體內(nèi)發(fā)光嗎？ 可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在與對可見光的穿透性不同，我們的技術(shù)可以看到成體正常老鼠的體內(nèi)發(fā)光。這正是這項技術(shù)的價值所在。
熒光檢測與生物發(fā)光檢測的優(yōu)勢與劣勢比較如何？熒光發(fā)光需要激發(fā)光使得熒光基團達(dá)到較高的能量水平，然后發(fā)射出較長波長的發(fā)射光。兩種常見的熒光蛋白：綠色熒光蛋白（green fluorescent protein）和紅色熒光蛋白或DsRed，這些蛋白熒光局限于可見光400-650nm范圍。但生物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，也會發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度。特別是當(dāng)發(fā)光細(xì)胞深藏于組織內(nèi)部，則需要較高能量的激發(fā)光源，也就會產(chǎn)生很強的背景噪音。生物發(fā)光成像相對于熒光成像，其靈敏度高。作為體內(nèi)報告源，生物發(fā)光較之熒光的優(yōu)點之一為不需要激發(fā)光的激發(fā), 它是以酶和底物的特異作用而發(fā)光, 且動物體自身不會發(fā)光，這樣生物發(fā)光就具有極低的背景。雖然熒光信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)強于生物發(fā)光，但極低的自發(fā)光水平使得生物發(fā)光的信噪比遠(yuǎn)高于熒光。另外, 生物發(fā)光信號可以方便計量，即便標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，亦可從動物體表的信號水平直接得出發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量。而對于熒光，信號水平取決于發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量及激發(fā)光的強度，光線穿過的組織對其有強烈的吸收，這使得熒光強度很難計量。由于熒光素酶在表達(dá)后快速合成并具有較短的壽命，而成為環(huán)境條件快速變化（如感染疾?。┑姆磻?yīng)探針?？筛鶕?jù)兩者所具有的特點以及實驗要求如組織的光學(xué)條件（報告源的深度、體積及組織吸光度等），選擇所適合的發(fā)光探針。
有幾種常用的熒光素酶？特性如何？有兩種常用的熒光素酶，luciferase 和 renilla的熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是luciferin，后者的底物是coelentarizine 。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長在540-600nm，后者所發(fā)的光波長在460-540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織。后者在體內(nèi)的代謝比前者快，但由于coelentarizine的原因，會有一些非特異性發(fā)光。所以，通常使用前者用作報告基因。
熒光素酶的發(fā)光特性如何？熒光素腹腔注射老鼠后約一分鐘后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光，十分鐘后強度達(dá)到最高。在最高點持續(xù)約法20-30 分鐘后開始衰落，約三小時后熒光素排除，發(fā)光全部消失。所以，最好的檢測時間是在注射后15到25分鐘之間。
熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光？熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素(LUCIFERIN)。熒光素是一種水溶性和脂溶性都非常好的小分子，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。
如何保證熒光素酶(Luciferase)的穩(wěn)定性？熒光素酶基因是插到細(xì)胞染色體內(nèi)的，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。熒光素酶的半衰期約三個小時, 所以只有活細(xì)胞才能夠持續(xù)表達(dá)熒光素酶。
標(biāo)記的腫瘤接種以后，會發(fā)生luciferase的丟失嗎？
從理論上會，但是還沒有正式的報道。丟失的量，非常小，可以忽略不記，不會影響實驗結(jié)果。當(dāng)腫瘤傳很多代長很大時，已經(jīng)有很多細(xì)胞死亡，不具有觀察的意義。
如何定量分析？采取絕對光子數(shù)的計算方法，記錄單位時間內(nèi)、單位面積、單位角度接受到的光子數(shù)。這樣，不同時間、不同儀器的測量結(jié)果可以進(jìn)行比較，具有絕對的定量意義。每一個新標(biāo)記的細(xì)胞株都要進(jìn)行全面的定量分析才能用于定量實驗，其中包括在體外和體內(nèi)固定位置細(xì)胞發(fā)光的標(biāo)準(zhǔn)曲線。提供的每一種熒光酶標(biāo)記的細(xì)胞株都做過精確全面的分析。我們也為客戶免費提供這些分析的方法。
儀器的解析度如何？分辨率如何？ 儀器的最高解析度在0.1毫米左右。最新的儀器IVIS 200的最高解析度可達(dá)到60um, 在體外可觀察到單個發(fā)光細(xì)胞。由于可見光是漫射光，在體內(nèi)走的路線不是直線，所以該儀器的體內(nèi)光源的分辨率不是很好，通過該儀器觀察的發(fā)光圖片不能代表發(fā)光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，在動物體表所捕捉的發(fā)光信號只能代表發(fā)光的強度和大概的位置。小動物CT和MRI，在這方面具有優(yōu)勢，因為放射線走的路線很直。
發(fā)光的波長與體內(nèi)的穿透性如何關(guān)系？
熒光素酶發(fā)出的光主要是偏紅光，與綠色熒光蛋白(GFP)的綠色熒光不同。熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強近一百倍。因為光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍(lán)綠光波段的大部分。但是在可見光大于600
納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。
可以用熒光素酶基因標(biāo)記干細(xì)胞嗎？如何標(biāo)記？
可以，標(biāo)記干細(xì)胞有兩種方法。一種是標(biāo)記組成性表達(dá)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，干細(xì)胞就被標(biāo)記了，從此小鼠的骨髓取出造血干細(xì)胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術(shù)示蹤造血干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過程。另外一種方法是用慢病毒標(biāo)記干細(xì)胞。以上內(nèi)容都有相關(guān)的文獻(xiàn)報道。
該技術(shù)在抗腫瘤新藥研究方面的應(yīng)用如何？在用該技術(shù)進(jìn)行抗腫瘤新藥的研究方面，主要是藥效學(xué)評價。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術(shù)有更高的靈敏度，當(dāng)用傳統(tǒng)的方法，還不能檢測到瘤塊時，用該技術(shù)已經(jīng)可以檢測到很強的信號。還有由于該技術(shù)只是檢測活躍的細(xì)胞，那些已經(jīng)凋亡的癌細(xì)胞是檢測不到的，而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常的癌細(xì)胞與凋亡的癌細(xì)胞，所以該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更早的發(fā)現(xiàn)藥物的療效，比傳統(tǒng)方法更靈敏。目前已經(jīng)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行的抗腫瘤藥效研究的有SU11248（很可能上市的乳腺癌新藥），Topotecan（已經(jīng)上市的抗腫瘤新藥） 等。
組織切片可以觀察到生物發(fā)光嗎？可以，但熒光酶的體外活性保持時間比較短， 約幾十分鐘。有相關(guān)的文獻(xiàn)。
熒光素酶的表達(dá)高低與所用啟動子的活性有關(guān)嗎？有關(guān)，啟動子的活性高，則熒光素酶的表達(dá)高，啟動子的活性低，則熒光素酶的表達(dá)低。還可以根據(jù)此原理，用特定的啟動子驅(qū)動熒光素酶，來觀察該啟動子在活體動物體內(nèi)的特定條件下的表達(dá)情況，并檢測影響該啟動子表達(dá)的因素。這正體現(xiàn)了應(yīng)用活體成像技術(shù)研究的優(yōu)勢。
能標(biāo)記病毒嗎？能標(biāo)記病毒的某一個基因嗎？可以標(biāo)記病毒，由于病毒在核酸結(jié)構(gòu)上的特性，每個病毒標(biāo)記的方法不一樣，具體的可以參見有關(guān)文獻(xiàn)。還沒有看到標(biāo)記病毒某一個基因的報道， 但理論上講，將熒光素酶基因與想標(biāo)記的基因平行表達(dá)，可以標(biāo)記任何基因。
細(xì)菌標(biāo)記問題
對于細(xì)菌標(biāo)記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。 利用這種辦法進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細(xì)菌標(biāo)記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細(xì)菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。精諾真公司已經(jīng)標(biāo)記好了幾十種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，在這方面很有經(jīng)驗。具體標(biāo)記情況請與我們直接聯(lián)系。
正常成體小鼠可以看到體內(nèi)發(fā)光嗎？ 是否不需要裸鼠？
可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在與對可見光的穿透性不同，我們的技術(shù)可以看到成體正常老鼠的體內(nèi)發(fā)光。這正是這項技術(shù)的價值所在。可見光的穿透能力在3-4cm，所以大鼠也可以作為活體成像的動物， 并有很多關(guān)于大鼠的文章。
為何能看到體內(nèi)發(fā)出的可見光？
兩個主要原因使能夠看到體內(nèi)發(fā)出的微弱的可見光。一是高靈敏度的制冷CCD鏡頭，可達(dá)到零下-105°C，使體內(nèi)發(fā)出的非常少的光子也能夠檢測到。 二是絕對密封的暗箱裝置，可以屏蔽包括宇宙射線在內(nèi)的所有光線。
能檢測在組織內(nèi)部的發(fā)光嗎？光能透過肌膚多深？
可以。若有發(fā)光足夠強的標(biāo)記細(xì)胞，在老鼠體內(nèi)任何一個地方都能看到約一立方毫米的細(xì)胞瘤(約106細(xì)胞)。穿透性可達(dá)到3-4CM 。
儀器靈敏度如何？
儀器對發(fā)光細(xì)胞檢測的靈敏度與細(xì)胞發(fā)光的強度有關(guān)。在標(biāo)記細(xì)胞活躍發(fā)光的情況下， 儀器可以檢測到最少100個皮下接種的發(fā)光細(xì)胞。若細(xì)胞在體內(nèi)位置深(如原位種植)，比如內(nèi)臟，最少能檢測到的細(xì)胞數(shù)目需要多一些。一般每增加0.5cm可檢測到的最少細(xì)胞數(shù)增加一個數(shù)量級。具體評論見BLOOD 2003 年的一篇文章：
“the sensitivity of cell detection in vivo is surprisingly high and exceeds even the sensitivity of detection by flow cytometry ex vivo. As few as 7x103 cells are detectable in the lungs early after injection, 2-2.5x104 cells within liver or spleen, and as few as 1x104 tumor cells within the BM of a femur give rise to a sufficient signal to be detected externally. In other experiments using cells with even higher luciferase expression, as few as 100 cells can be reliably detected in the peritoneal cavity of living animals. BLOOD, 2003, V.101, pp640-8
能檢測分散在各處的單個細(xì)胞嗎?
可以檢測到流體的細(xì)胞，只要細(xì)胞總數(shù)達(dá)到100以上。我們可以提供許多文章，其中用熒光素酶標(biāo)記了T細(xì)胞, NK細(xì)胞, 造血干細(xì)胞和其他淋巴細(xì)胞。在這些標(biāo)記的細(xì)胞總數(shù)達(dá)到一百以上時，我們的儀器可以觀察到信號（見上篇關(guān)于T細(xì)胞的索引）。IVIS 200的體外檢測可以觀察到單個細(xì)胞。
體內(nèi)可見光技術(shù)的發(fā)展過程是怎樣的？
精諾真的研究人員在1995年對此技術(shù)開始研究，技術(shù)在1999年才開始成熟，精諾真的商業(yè)產(chǎn)品在2000年出現(xiàn)在市場上。但大量的研究工作是在最近兩年才開始的。技術(shù)開始流行起來，多數(shù)的文章也是在最近兩年發(fā)表的。國內(nèi)已經(jīng)有四家單位購買了該系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)的研究，有很多的科研工作者對這項技術(shù)產(chǎn)生了濃厚的興趣，越來越多的人開始計劃用該技術(shù)進(jìn)行腫瘤學(xué)、流行病學(xué)、藥物研究等。
可以用該技術(shù)研究基因表達(dá)嗎？
可以，研究基因表達(dá)可以從影響基因表達(dá)的各個不同的層面進(jìn)行相關(guān)的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk細(xì)胞分裂周期的表達(dá)Nature Medicine 2004）, 興趣基因啟動子控制的熒光素酶（Catenin在腫瘤轉(zhuǎn)移的信號傳導(dǎo)機制Nature 2005）, iRNA方式（HCV-luc的iRNA抑制表達(dá)Nature 2002）, 和轉(zhuǎn)基因動物（NFkB在Hypoxia的表達(dá)JCI 2004）等方法。若有興趣，可以與我們索取相關(guān)文章。
可以研究蛋白質(zhì)核運輸嗎？
可以。研究方法類似于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質(zhì)的基因，另一端接肯定在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的蛋白的基因，當(dāng)核外的蛋白運輸?shù)胶藘?nèi)時，就會導(dǎo)致熒光素酶N斷、C端靠近，恢復(fù)發(fā)光。
該技術(shù)只是能示蹤細(xì)胞的走向，而不能進(jìn)行相關(guān)的機理研究？
不對。該技術(shù)最初的應(yīng)用是在觀察腫瘤細(xì)胞、病原微生物或干細(xì)胞的走向，分布等，但是目前隨著該技術(shù)的普及，其應(yīng)用已經(jīng)擴展到很多方面，原來只能在分子水平上研究的內(nèi)容，現(xiàn)在也可以在整體動物水平上進(jìn)行更接近活體環(huán)境狀態(tài)的研究，如蛋白質(zhì)相互作用，細(xì)胞凋亡，基因表達(dá)等等。 基本上把分子生物學(xué)在體外的一些研究方法在體內(nèi)進(jìn)行實現(xiàn)。由于體內(nèi)與體外的各種微環(huán)境上的差異，造成體外實驗結(jié)果對活體生物機理研究的局限性，相信在整體水平的研究，必將有廣闊的發(fā)展空間。
在藥物臨床前研究中的應(yīng)用如何？
利用活體成像技術(shù)高靈敏度，觀察方便的特點，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過給予腫瘤接種的小鼠不同的劑量，并不同的給藥時間、不同的給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量并給藥時間，從而制定合適的劑型與服藥時間。我們搜集了許多藥物研究方面的相關(guān)文獻(xiàn)，請同我們聯(lián)系， 希望與您共享。
相對于傳統(tǒng)技術(shù)，在腫瘤學(xué)研究中的優(yōu)勢在哪里？
有更高的靈敏度，可以定量研究，可以方便的觀察腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的情況，可以避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異，可以節(jié)省動物的成本。 并且應(yīng)為這項技術(shù)的超靈敏性，微小的腫瘤轉(zhuǎn)移灶（少到100多個細(xì)胞）就可以檢測到。 比用傳統(tǒng)方法可以檢測到的靈敏度大大提高。也可應(yīng)用
轉(zhuǎn)基因技術(shù)制作自發(fā)腫瘤模型從事相關(guān)的研究。
如何進(jìn)行相關(guān)疾病機理的研究？
可以標(biāo)記與某種疾病密切相關(guān)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，通過特定的藥物作用或其他條件下，該基因表達(dá)的變化，來推測該疾病的發(fā)病機理，藥物對該疾病治療的效果等。我們已經(jīng)標(biāo)記好了幾十種轉(zhuǎn)基因動物提供給研究人員，也提供相關(guān)方面的服務(wù)。
在中醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用前景如何？
由于該技術(shù)在整體動物水平上觀察生物學(xué)變化，與中醫(yī)的整體觀念有些相似。目前，有很多中藥在治療疾病上有很好的療效，但是由于其復(fù)雜的組分，復(fù)雜的作用機理，很難用目前的分子水平的研究解釋清楚。如果從宏觀的水平，根據(jù)所研究內(nèi)容的不同，應(yīng)用該技術(shù)的一些疾病模型，從基因表達(dá)等方面觀察某些中藥的治療效果，將是一個不錯的方向。臺灣的中醫(yī)學(xué)界在這個方面有很深的研究。
在免疫學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用如何？
觀察流體細(xì)胞在體內(nèi)的動向和變化是這個技術(shù)的一大優(yōu)勢。 可以標(biāo)記免疫細(xì)胞，如T 細(xì)胞，NK細(xì)胞，觀察免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺死。也可以標(biāo)記干細(xì)胞及異體細(xì)胞，觀察干細(xì)胞演化和器官移植的研究。也有一些關(guān)于免疫因子的研究報道等。
相對傳統(tǒng)技術(shù)，在抗生素藥物篩選方面的優(yōu)勢如何？
同一批老鼠持續(xù)觀察，避免個體間差異； 有更高的靈敏度，可以在感染早期就進(jìn)行活體觀察?？梢杂薪Y(jié)構(gòu)信息，在活體動物整體上觀察感染途徑。定量，可以比較各個器官的感染程度，更直觀?，F(xiàn)今已有很多跨國公司利用此技術(shù)結(jié)果作為藥物臨床前重要的數(shù)據(jù)報給FDA。 請同我們聯(lián)系，我們可以提供相應(yīng)資料。
在RNA阻斷方面的應(yīng)用如何？可以標(biāo)記siRNA嗎？
可以用熒光素酶基因標(biāo)記興趣基因，利用熒光素酶的iRNA觀察其對興趣基因的表達(dá)抑制（Nature 2002）。也可以標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，間接觀察阻斷RNA對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷。
