法國科學(xué)家Emmanuelle Charpentier與美國科學(xué)家Jennifer Doudna
五分鐘前，瑞典皇家科學(xué)院宣布，2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予加州大學(xué)詹妮弗·杜德納（ Jennifer Doudna） 和現(xiàn)在德國工作的法國科學(xué)家Emmanuelle Charpentier，表彰她們發(fā)明基因修飾方法CRISPR-Cas9。這一工作由來已久，最后技術(shù)突破是2012年Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier。但在她們之前和之后，有多位科學(xué)家的貢獻(xiàn)，所以一直不清楚她們之外，還有誰會(huì)與她們共享。北京時(shí)間2020年10月7日下午，諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)做出了選擇：加州大學(xué)伯克利分校教授詹妮弗·杜德納和德國馬普感染生物學(xué)研究所教授埃馬紐爾·夏彭蒂耶因“研發(fā)出一種基因組編輯方法”獲得2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。華人科學(xué)家張鋒被認(rèn)為是諾貝爾獎(jiǎng)的熱門人選。CRISPR是 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）這一短語的首字母縮寫，是基因組DNA上的一段特殊的序列，源于細(xì)菌及古細(xì)菌中一種獲得性免疫系統(tǒng)，能夠識別出入侵細(xì)菌的病毒，并通過一種特殊的酶破壞入侵的病毒。實(shí)際上，人們第一次發(fā)現(xiàn)CRISPR序列是在1987年，由日本分子生物學(xué)家石野良純（Yoshizumi Ishino）在大腸桿菌中偶然發(fā)現(xiàn)，但是第一次證明CRISPR/Cas9可以進(jìn)行基因編輯，是美國分子生物學(xué)家杜德納和瑞典于默奧微生物研究中心的法國微生物學(xué)家夏彭蒂耶在《科學(xué)》雜志發(fā)表的第一篇研究論文。在2012年6月發(fā)表的論文中，兩位女性科學(xué)家?guī)ьI(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)純化了Cas9蛋白，發(fā)現(xiàn)它是雙RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶，首次在體外證明使用Cas9的CRISPR系統(tǒng)可以切割任意DNA鏈，指出CRISPR在活細(xì)胞中修改基因的能力。這是最早發(fā)表的把細(xì)菌天然免疫系統(tǒng)演變成CRISPR/Cas9基因編輯工具的工作。因?yàn)楹唵?、廉價(jià)和高效，CRISPR已經(jīng)成為全球最為流行的基因編輯技術(shù)，被稱為編輯基因的“魔剪”。科學(xué)家通過它可以高效、精確地改變、編輯或替換植物、動(dòng)物甚至是人類身上的基因，經(jīng)過改造的CRISPR技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。瑪麗亞·賈辛的貢獻(xiàn)
瑪麗亞·賈辛（Maria Jasin）于1984年在麻省理工學(xué)院獲得了博士學(xué)位，師從Paul Schimmel教授。之后分別在蘇黎世大學(xué)和斯坦福大學(xué)進(jìn)行博士后研究。結(jié)束博士后訓(xùn)練后，她在紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心建立了自己的實(shí)驗(yàn)室。
賈辛的研究從一種叫做DNA同源重組的細(xì)胞生命活動(dòng)開始。由于細(xì)胞內(nèi)的DNA經(jīng)常受到損傷，特別是雙鏈發(fā)生斷裂時(shí)，如果不能很好地修復(fù)會(huì)對細(xì)胞造成致命的影響。細(xì)胞內(nèi)有一套機(jī)制，能讓受傷的DNA以與其同源的序列（一般來源于其等位基因，也就是從雙親中的另一方繼承的相同的基因）為模板來自我修復(fù)，這個(gè)過程即稱為同源重組。
1990年代后期，賈辛的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因BRAC1和BRAC2的突變和乳腺癌以及卵巢癌有很強(qiáng)的相關(guān)性。經(jīng)過研究，他們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因參與DNA同源重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)不僅大大加深了人們對DNA修復(fù)機(jī)制的理解，而且具有極大的臨床價(jià)值。例如，在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一類小分子，能抑制PARP通路，目前已廣泛用于BRCA基因突變導(dǎo)致的腫瘤的治療。
在研究同源重組的過程中，賈辛使用了一種內(nèi)切酶（I-SceI）來產(chǎn)生DNA斷裂。在一種小鼠細(xì)胞中導(dǎo)入了這個(gè)酶以后，賈辛發(fā)現(xiàn)細(xì)胞基因組發(fā)生了改變。她敏銳地意識到，這個(gè)過程可以用來在活體細(xì)胞中改變基因，也就是我們現(xiàn)在所說的基因編輯。1994年，她將這個(gè)發(fā)現(xiàn)寫成論文投稿，然而卻接連被四五家頂級雜志拒稿?！犊茖W(xué)》雜志甚至沒有將手稿送審。賈辛后來回憶道：“因?yàn)槟莻€(gè)時(shí)候沒人對這種類型的DNA修復(fù)感興趣”。幸運(yùn)的是，最終這篇文章被《分子細(xì)胞生物學(xué)》雜志接受，成為了基因編輯領(lǐng)域的奠基之作。
賈辛的工作為后來的基因編輯提供了以同源重組修復(fù)的方式進(jìn)行的理論基礎(chǔ)。但受限于當(dāng)時(shí)的知識，賈辛未能找到在基因組特定位點(diǎn)導(dǎo)入雙鏈斷裂的方法。直到2003年，戴納·卡羅爾（Dana Carroll）等人利用鋅指蛋白解決了在特定位點(diǎn)引入雙鏈斷裂的問題，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯才真正成為可以實(shí)現(xiàn)的技術(shù)。今天，CRISPR技術(shù)已經(jīng)使基因編輯變得非常容易，但我們不應(yīng)忘記，正是賈辛早期的工作使基因編輯成為可能。
最早證明CRISPR-Cas9可以編輯哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因的華人科學(xué)家、麻省理工學(xué)院教授、博德研究所資深研究員張鋒（Feng Zhang）和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授喬治·徹奇（George Church）無緣此次諾貝爾獎(jiǎng)。在此之前，1993年諾獎(jiǎng)得主、麻省理工學(xué)院教授菲利普·夏普（Phillip Sharp）曾表示，基于CRISPR的基因編輯技術(shù)有四個(gè)關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)者：夏彭蒂耶、徹奇、杜德納和張鋒。所以，諾獎(jiǎng)最多頒給三人的規(guī)則顯然就是個(gè)問題。他認(rèn)為，一個(gè)比較明智的決定可能是：諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給杜德納和夏彭蒂耶，她們的工作是純生化，生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)給徹奇和張鋒，他們在活體細(xì)胞中成功應(yīng)用CRISPR，為醫(yī)學(xué)的應(yīng)用鋪平了道路。雖然張鋒與此次諾獎(jiǎng)無緣，但他和博德研究所在美國擁有CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于所有真核生物——包括植物、動(dòng)物和人類——的專利，這是CRISPR技術(shù)商業(yè)化最為核心的專利之一。2013年1月，張鋒和徹奇同時(shí)在《科學(xué)》雜志分別發(fā)表論文，將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功地運(yùn)用到小鼠和人類細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了CRISPR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯。而在幾周之后，杜德納實(shí)驗(yàn)室也發(fā)表了類似的結(jié)果。憑借證明自己的實(shí)驗(yàn)室在2011年就開始有了把Cas蛋白簇和tracrRNA放到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的想法，并第一個(gè)證明CRISPR/Cas9整個(gè)概念，使CRISPR技術(shù)從最初的構(gòu)想到在哺乳動(dòng)物細(xì)胞成功應(yīng)用的證據(jù)，張鋒在2014年4月獲得美國專利與商標(biāo)局關(guān)于CRISPR的首個(gè)專利授權(quán)。對于這一結(jié)果，更早提交專利申請的杜德納和加州大學(xué)伯克利分校并不認(rèn)可，并在2015年4月提交申訴材料。2016年1月，關(guān)于誰首先發(fā)明了CRISPR技術(shù)，加州大學(xué)伯克利分校和麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)博德研究所展開交鋒。杜德納和加州大學(xué)伯克利分校認(rèn)為，張鋒只是杜德納論文的諸多跟進(jìn)者之一，將CRISPR運(yùn)用到小鼠和人類細(xì)胞上只需要常規(guī)技術(shù)。但張鋒一方的理由是：杜德納只是預(yù)測CRISPR會(huì)在人類細(xì)胞上有效，自己是第一個(gè)將CRISPR運(yùn)用到人類細(xì)胞中的人。隨后，美國專利與商標(biāo)局宣布正式啟動(dòng)干涉程序，將重新宣判CRISPR專利的歸屬問題。2017年2月，三名專利法官組成的小組一致裁決，張鋒等人2014年申請的專利“在事實(shí)上毫無爭議”，與加州大學(xué)伯克利分校申請的專利并無沖突。根據(jù)這一裁定，杜德納和加州大學(xué)伯克利分校覆蓋關(guān)于CRISPR的所有專利，而張鋒和博德研究所擁有其中的一項(xiàng)關(guān)鍵專利。不過，加州大學(xué)伯克利分校在接受媒體采訪時(shí)表示尊重專利法庭的裁決，但還是將會(huì)上訴至美國聯(lián)邦巡回上訴法院。2018年9月10日，美國聯(lián)邦法院的裁決支持了專利上訴委員會(huì)2017年2月對基因編輯技術(shù)CRISPR專利的決定。專利上訴委員會(huì)認(rèn)為，博德研究所擁有的CRISPR專利，并未侵犯伯克利以及維也納大學(xué)的利益。CRISPR基因編輯技術(shù)背后的科學(xué)家事實(shí)上，CRISPR技術(shù)今天能夠給整個(gè)科學(xué)界和農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥領(lǐng)域帶來暴風(fēng)驟雨般的變革，其發(fā)現(xiàn)離不開一大批科學(xué)家和博士研究生的貢獻(xiàn)。博德研究所所長埃里克·蘭德（Eric Lander）曾經(jīng)就CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)明過程總結(jié)了一篇“CRISPR英雄譜”：1993年，西班牙科學(xué)家弗朗西斯科·莫伊卡（Francisco Mojica）首先在嗜鹽古細(xì)菌（Haloferax mediterranei）的基因組中發(fā)現(xiàn)了大約30個(gè)堿基對（bp）長度的回文重復(fù)序列，這些序列由36bp的間隔序列隔開。2005年，經(jīng)過生物信息學(xué)序列比對方法，莫伊卡發(fā)現(xiàn)，CRISPR序列中三分之二的間隔序列為病毒或外源質(zhì)粒的序列，他意識到CRISPR系統(tǒng)與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)。與此同時(shí)，法國科學(xué)家吉利斯·維格諾德（Gilles Vergnaud）和俄國科學(xué)家亞歷山大·博洛廷（Alexander Bolotin）在2005年分別獨(dú)立得到與莫伊卡類似的結(jié)論，即CRISPR與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)。2007年，法國分子生物學(xué)家、杜邦公司職員菲利普·霍瓦特（Philippe Horvath）和他的同事魯?shù)婪颉ぐ吞m右（Rodolphe Barrangou）以及微生物學(xué)家Sylvain Moineau在研究生產(chǎn)酸奶的乳酸桿菌對噬菌體的抗性時(shí)，發(fā)現(xiàn)了Cas7和 Cas9蛋白在CRISPR中的作用：Cas7產(chǎn)生間隔和重復(fù)序列，Cas9則是核酸酶。2008年8月，荷蘭科學(xué)家范德歐斯特（John van der Oost）通過生物化學(xué)方法鑒定了一系列Cas蛋白，并發(fā)現(xiàn)這些蛋白需要切割一段長為61堿基的前體RNA（crRNA）才能工作。他們證明了crRNA的作用，并通過人為設(shè)計(jì)相應(yīng)的crRNA序列使菌株獲得了抵抗噬菌體的特性。這是人類首次編輯CRISPR系統(tǒng)。2008年12月， 阿根廷科學(xué)家盧西亞諾·馬拉夫尼（Luciano Marraffini）和他的導(dǎo)師埃里克·松特海姆（Erik Sontheimer）證實(shí)了CRISPR系統(tǒng)的底物是DNA，并且意識到該系統(tǒng)可能可用于DNA編輯。2010年12月，西爾萬·莫伊諾（Sylvain Moineau）證實(shí)了核酸酶Cas9可以在crRNA的指導(dǎo)下對特定序列的DNA進(jìn)行切割。2011年7月，立陶宛科學(xué)家維吉尼亞斯·斯克斯尼斯（Virginijus Siksnys）在大腸桿菌中重組了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)，證實(shí)了該系統(tǒng)至少需要Cas9核酸酶，crRNA和tracrRNA三個(gè)組分，這一結(jié)果2012年9月發(fā)表于《美國國家科學(xué)院刊》（PNAS）。2012年8月，杜德納和夏彭蒂耶發(fā)表關(guān)鍵性的實(shí)驗(yàn)，揭示CRISRP/Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因編輯的分子機(jī)制。不過，蘭德的這篇文章被認(rèn)為將榮譽(yù)歸實(shí)驗(yàn)室的領(lǐng)導(dǎo)者，而忽視了博士后和研究生的貢獻(xiàn)。《自然》新聞曾經(jīng)寫過一篇文章，詳細(xì)介紹了在開發(fā)CRISPR/Cas9技術(shù)的過程中，杜德納實(shí)驗(yàn)室的博士后布萊克·威登赫夫特（Blake Wiedenheft）和馬丁·伊內(nèi)克（Martin Jinek），張鋒實(shí)驗(yàn)室的叢樂，徹奇實(shí)驗(yàn)室的博士研究生楊璐菡，立陶宛維爾紐斯大學(xué)維吉尼亞斯·斯克斯尼斯團(tuán)隊(duì)的博士研究生基迪斯·加西烏納斯（Giedrius Gasiunas）等做出的貢獻(xiàn)。“近期很少有一個(gè)發(fā)現(xiàn)能夠像CRISPR在生物領(lǐng)域一樣，改變整個(gè)領(lǐng)域的研究。它在人類健康與疾病等方面有極大的應(yīng)用潛力?！?018年8月，美國阿爾伯尼生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)委員會(huì)主席Vincent Verdile博士曾這樣說。實(shí)際上，在諾貝爾獎(jiǎng)?lì)C給CRISPR之前，CRISPR早已得到眾多獎(jiǎng)項(xiàng)的認(rèn)可，為相關(guān)的研究者帶來大量的榮譽(yù)。2014年，杜德納與夏彭蒂耶共同分享了2015年生命科學(xué)突破獎(jiǎng)，每人獲得300萬美元的獎(jiǎng)金。2015年，杜德納與夏彭蒂耶獲得西班牙的阿斯圖里亞斯女親王獎(jiǎng)（Premios Princesa de Asturias）中的科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)項(xiàng)。2016年3月9日，杜德納、夏彭蒂耶、魯?shù)婪颉ぐ吞m右、菲利普·霍瓦特和維吉尼亞斯·斯克斯尼斯因在理解CRISPR的細(xì)菌防御系統(tǒng)及其在基因編輯方面的革命性發(fā)現(xiàn)做出杰出貢獻(xiàn)獲得2016年度阿爾珀特獎(jiǎng)。2016年3月23日，杜德納、夏彭蒂耶與張鋒“因?qū)⒒蚓庉嫾夹g(shù)CRISPR-Cas應(yīng)用于真核細(xì)胞所作出的努力”獲得有“小諾貝爾獎(jiǎng)”之稱的加拿大蓋爾德納國際獎(jiǎng)（Gairdner International Award）。2016年6月19日，臺灣唐獎(jiǎng)的生技醫(yī)藥獎(jiǎng)再次頒給以上三人，以表彰他們?yōu)椤鞍l(fā)展CRISPR-Cas9系統(tǒng)成為突破性的基因編輯平臺”做出的貢獻(xiàn)。2017年2月2日，杜德納與夏彭蒂耶獲得2017年日本獎(jiǎng)（Japan Prize），每人獲得5000萬日元（約42萬美元）的獎(jiǎng)金。2018年5月31日，杜德納、夏彭蒂耶和斯克斯尼斯獲得卡弗里納米科學(xué)獎(jiǎng)。杜德納關(guān)于發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)基因編輯的回顧：
在與夏彭蒂耶、張鋒一起獲頒臺灣唐獎(jiǎng)的一個(gè)報(bào)告中，杜德納回顧了她和夏彭蒂耶是如何發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9可以實(shí)現(xiàn)基因編輯的。我們和夏彭蒂耶合作，用生物化學(xué)方法純化了 Cas9 蛋白，發(fā)現(xiàn)它是雙 RNA 引導(dǎo)的 DNA 內(nèi)切酶，意思是這個(gè)蛋白能夠和兩條不同的 RNA 結(jié)合。一條是包含引導(dǎo)序列的 crRNA，能和DNA進(jìn)行堿基配對。在合作的過程中我們發(fā)現(xiàn)，另一條 tracrRNA 對于 crRNA 的加工處理很重要，對于尋找目標(biāo) DNA 的能力也是必要的，所以這是一個(gè)兩條 RNA 的系統(tǒng)在和蛋白交互作用，形成進(jìn)行監(jiān)控的復(fù)合體。這個(gè)蛋白的運(yùn)作方式是靠兩把化學(xué)剪刀，在目標(biāo)區(qū)域?qū)?DNA 旋開后進(jìn)行切割。重要的是，要切割的目標(biāo)位置，必須是在 DNA 上的 PAM 模體旁邊。在了解運(yùn)作的機(jī)制之后，我們意識到其實(shí)可以把系統(tǒng)進(jìn)一步簡化，弄得比自然界更為簡單。我們將兩條 RNA 合而為一，形成單鏈引導(dǎo)型態(tài)：一端包含需要搜尋的目標(biāo)序列，另一段是和 Cas9 結(jié)合所需要的資訊。如此簡化成雙分子系統(tǒng)，一個(gè)蛋白被一條 RNA 引導(dǎo)至 DNA 序列，制造DNA 的雙股斷裂。如果要鎖定新的目標(biāo)，只要變更RNA 這一小段序列，任何分生學(xué)家都可以輕易在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)辦到。我們?yōu)榇烁械胶芘d奮，因?yàn)槲覀兞私獾竭@顯然是可以程式化的蛋白。設(shè)定指令即可導(dǎo)向不同的DNA序列，進(jìn)行雙股切割。
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