鄔玲仟，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)博士，教授，婦產(chǎn)科一級主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師?，F(xiàn)任中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任、湘雅醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心主任、湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心副主任、湖南家輝遺傳?？漆t(yī)院首席醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師。兼任中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會會長、中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分會副主任委員、國家衛(wèi)計(jì)委產(chǎn)前診斷專家組專家、產(chǎn)前診斷培訓(xùn)基地負(fù)責(zé)人。長期致力于遺傳病發(fā)病機(jī)制、診斷與產(chǎn)前診斷技術(shù)研究、教學(xué)和臨床服務(wù)，率先在國內(nèi)建立了以微芯片和高通量測序技術(shù)為核心的遺傳病診斷和產(chǎn)前診斷高技術(shù)平臺及其技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范、研發(fā)“染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)”在國際上首家獲得臨床許可并在全國推廣應(yīng)用，創(chuàng)建“循環(huán)單分子擴(kuò)增重測序技術(shù)（cSMART）”率先突破單基因病無創(chuàng)產(chǎn)前診斷，被美國臨床化學(xué)學(xué)會（AACC）譽(yù)為“分子診斷的革命性突破”。
【本期課程摘要】
一、產(chǎn)前診斷
1. 產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis）的定義：是指對胎兒進(jìn)行先天性缺陷和遺傳性疾病的診斷，檢測手段包括：影像學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞和分子遺產(chǎn)學(xué)，以及分子生物學(xué)等。
2. 產(chǎn)前診斷的好處：（1）陰性結(jié)果使孕婦安心；（2）明確診斷疾病，部分疾病可提供產(chǎn)前治療；（3）選擇合適的生育場所盡可能保證安全分娩；（4）選擇合適醫(yī)院對患病胎兒提供出生時(shí)治療；（5）提供終止妊娠的機(jī)會；以利于提高人口素質(zhì)，降低出生缺陷。
二、遺傳病與遺傳學(xué)檢測方法
1. 遺傳病包括：染色體?。òㄈ旧w數(shù)目異常、片段缺失與重復(fù)、微缺失與微重復(fù)）、基因組病、單基因?。▎位虿 ⒍嗷虿?、線粒體病），多基因病，體細(xì)胞突變遺傳病等。
2. 產(chǎn)前診斷的對象是嚴(yán)重遺傳性疾病，是指由于遺傳因素先天形成，患者全部或者部分喪失自主生活能力，后代再現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)高，醫(yī)學(xué)上認(rèn)為不宜生育的遺傳性疾病，包括染色體病、基因組病以及一部分嚴(yán)重的致愚、致殘、致死性的單基因病。
3. 遺傳學(xué)檢測方法
染色體病和基因組病目前已經(jīng)有很好的檢測平臺，染色體疾病診斷顯帶技術(shù)平臺可以一次性看到46條染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；基因組病染色體微缺失微重復(fù)診斷技術(shù)平臺通過芯片或高通量測序，也可以一次性看到整個(gè)細(xì)胞基因組的異常；但是，單基因疾病共有7000多個(gè)，目前能夠檢測的有3000多個(gè)，不同的疾病有不同的遺傳病理特點(diǎn)，選擇的檢測方法也不一樣，因此，臨床醫(yī)生需要對這部分疾病有深刻的認(rèn)識，選擇恰當(dāng)?shù)臋z測技術(shù)，才能更好地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)前診斷和咨詢。
遺傳學(xué)檢測方法包括以下幾種：
1)染色體核型分析：通過顯帶技術(shù)（如G顯帶）來檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)是否存在異常；其分辨率有限，多大于5MB（整個(gè)基因組是2.8GB，大部分實(shí)驗(yàn)室是做320-400條帶，這種情況就要大于10MB），因此無法分辨小的染色體缺失或重復(fù)。
2)基因組拷貝數(shù)變異檢測：通過染色體微陣列芯片（如SNP-array）等方法檢測染色體微小片段的缺失或重復(fù)；分辨率＞100KB，也有局限性，無法分辨幾個(gè)KB片段的缺失或插入。
下圖所示為一例染色體插入突變病例，患者表現(xiàn)為智障，小頭畸形，生活可以自理，當(dāng)?shù)夭槿旧w核型為正常，芯片結(jié)果顯示9號染色體長臂有16MB的重復(fù)。
3)Sanger測序和MLPA技術(shù)：對于單個(gè)堿基水平，可利用sanger測序，即一代測序，分辨率從1bp到數(shù)百bp，可用于檢測單個(gè)基因；MLPA（多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)）若是針對一個(gè)基因的一到兩個(gè)外顯子的缺失或重復(fù)，或是針對靶序列的點(diǎn)突變、缺失或重復(fù)的檢測。
4)二代測序（NGS）：可以一次檢測單個(gè)基因（single gene）、一組基因（gene panel）、在線人類孟德爾遺傳 (Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)基因外顯子、外顯子組（exome），及全基因組（whole genome）；分辨率達(dá)到1bp?，F(xiàn)在隨著這項(xiàng)技術(shù)的價(jià)錢逐漸降低，應(yīng)用得到推廣，但后兩種檢測由于其價(jià)格相對較高，分辨率高，會發(fā)現(xiàn)大量無法與表型關(guān)聯(lián)的變異，一般用于用于新生兒先證者的檢測。
下表展示了各種遺傳學(xué)檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)：
三、遺傳學(xué)檢測方法在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用
1.評估
1)評估胎兒患遺傳病的風(fēng)險(xiǎn)：
a)胎兒狀態(tài)：有無畸形、生長發(fā)育遲緩等；
b)孕婦孕期有無特殊：孕婦年齡，是否接觸有害物質(zhì)，產(chǎn)前篩查有無異常等；
c)其他：羊水量，胎盤狀況，是否為試管嬰兒等；
d)家族史：非常重要，夫婦是否為染色體異常攜帶者，是否生育過嚴(yán)重缺陷新生兒，家族中是否有遺傳病患者等。
2) 評估胎兒患遺傳病的種類：
a)染色體?。孩傺蛩^多或者過少；②胎兒發(fā)育異常或者有可疑畸形；③孕早期接觸過可能導(dǎo)致胎兒先天缺陷的物質(zhì)；④曾經(jīng)分娩過先天性嚴(yán)重缺陷嬰兒或者生育過染色體異?；純?；⑤夫婦雙方之一為染色體平衡易位、倒位或插入攜帶者；⑥孕婦年齡超過35周歲；⑦產(chǎn)前篩查提示胎兒染色體疾病高風(fēng)險(xiǎn)。
b)基因組異常?。?①胎兒發(fā)育異常或者有可疑畸形；②孕早期接觸過可能導(dǎo)致胎兒先天缺陷的物質(zhì)；③夫婦曾生育過智力低下、發(fā)育遲緩或器官畸形的患兒，且經(jīng)過遺傳學(xué)檢測診斷為基因組??；④夫婦雙方之一為基因組病攜帶者；⑤產(chǎn)前篩查提示胎兒基因組疾病高風(fēng)險(xiǎn)。
基因組病異常的評估標(biāo)準(zhǔn)大體與染色體病相似，但其獨(dú)有的一大特點(diǎn)是與母親年齡無關(guān)，只與基因組自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，每個(gè)個(gè)體基因組都含有低拷貝重復(fù)序列、串聯(lián)重復(fù)序列等，這些重復(fù)序列發(fā)生非等位同源重組，導(dǎo)致染色體的缺失或重復(fù)，通常為小片段缺失或重復(fù)，可以導(dǎo)致智力障礙，生長發(fā)育遲緩，及多發(fā)畸形等。
c)單基因?。孩俜驄D為隱性致病基因攜帶者或夫婦一方是顯性遺傳病患者；②曾生育過單基因病患兒；③胎兒發(fā)現(xiàn)明顯畸形，高度懷疑為某一遺傳?。ù朔N產(chǎn)前診斷較為困難）。
d)線粒體疾病、多基因遺傳病、體細(xì)胞突變遺傳?。号c單基因病類似，但其產(chǎn)鉗診斷膠南進(jìn)行，且由于很難以評估胎兒將來表型。一般不做產(chǎn)前診斷。
3)評估孕婦能否進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷：
a)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的禁忌癥：①完全性前置胎盤；②先兆流產(chǎn)未穩(wěn)定；③孕婦體溫超過37.2℃。
b)有創(chuàng)產(chǎn)鉗診斷慎用：①邊緣性或部分性前置胎盤；②孕婦為病毒攜帶者，如HBV，HIV；③孕婦血性為RH陰性。
2.檢測
1)選擇合適的取材方法和時(shí)間:
下表為不同取材方式的手術(shù)時(shí)間，胎兒丟失率及并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)：
2)選擇恰當(dāng)?shù)倪z傳學(xué)方法進(jìn)行檢測：
研究顯示，如胎兒B超有異常，基因芯片檢測，遺傳疾病檢出異常檢出率為6%，如B超無異常，只是篩查高風(fēng)險(xiǎn)，基因芯片遺傳異常的檢出率1. 7%，有顯著性差異。指南規(guī)定建議，如B超有異常，首先做芯片或高通量測序，而不是染色體核型檢測；如B超無異常，只是篩查高風(fēng)險(xiǎn)，可以選擇染色體核型或芯片檢測。單基因疾病是根據(jù)特定疾病來選擇相應(yīng)的檢測方式。
下面以假肥大性肌營養(yǎng)不良（DMD）來說明單基因病如何選擇恰當(dāng)?shù)倪z傳學(xué)方法進(jìn)行檢測。
首先，對710例DMD樣本基因檢測結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果占94.5%，其中大片段缺失或重復(fù)變異占72.7%，單個(gè)或小片段核苷酸變異占21.8%，陰性結(jié)果占5.5%。因此，DMD先證者診斷首選MLPA，先找大片段的缺失或重復(fù)，若MLPA陰性，再做一代或二代測序，尋找點(diǎn)突變，若結(jié)果為陰性，原因可能為診斷錯(cuò)誤或突變不在檢測的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)。DMD檢測流程見下圖。
由此可見，先證者的診斷了解單基因病的突變類型非常重要，有助于選擇恰當(dāng)?shù)臋z測方法，并幫助確認(rèn)臨床診斷的正確性。
3.結(jié)果：
1)分析檢測結(jié)果：
a)陽性結(jié)果：確定胎兒患遺傳?。?/span>
b)陰性結(jié)果：排除胎兒患某種或某類遺傳病風(fēng)險(xiǎn)；
c)臨床意義不明的結(jié)果：發(fā)現(xiàn)有變異，但不能確定該變異是否會導(dǎo)致胎兒患病。原因是染色體異常大部分是新發(fā)的，拷貝數(shù)變異（CNV）更是90%以上是新發(fā)的，即父母染色體正常，但在受精卵形成的過程中產(chǎn)生異常。這一類結(jié)果尤其要做好遺產(chǎn)咨詢，并且要做好新生兒隨訪，形成數(shù)據(jù)庫，以指導(dǎo)以后相同結(jié)果的咨詢。
下圖為臨床意義不明的結(jié)果的一個(gè)案例：
d)意外發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)與檢測目的無關(guān)的信息。
2)遺傳咨詢：
a)遺傳咨詢（Genetic Counseling）定義：是由臨床醫(yī)生和遺傳學(xué)工作者，解答遺傳病患者及家屬剔除提出的有關(guān)遺傳性疾病的病因、遺傳方式、診斷、治療及預(yù)防等問題，估計(jì)后代再患某病的概率，并提出建議及指導(dǎo)，一共以供患者及其親屬參考。
b)產(chǎn)前診斷中遺傳咨詢的特殊性：
i.胎兒不一定在孕期表現(xiàn)出相應(yīng)的表型；
ii.是否建議孕婦終止妊娠（倫理、種族、宗教等）；
iii.檢測材料的特殊性；
iv.懷孕時(shí)間與檢測時(shí)間的矛盾性。
c)幾種特殊情況：
i.嵌合體：很難評估表型，可以在咨詢中告知最嚴(yán)重和最輕的情況；
ii.外顯不全：在一個(gè)家系里，有的癥狀嚴(yán)重，有的癥狀很輕，要將這種情況告知病人；
iii.延遲顯性：根據(jù)患者的要求，若有治療的方法要告知患者以利于及早治療。
下圖顯示的是8號染色體三體嵌合體的一個(gè)案例。該案例中患者沒有智力障礙和嚴(yán)重畸形，生活可以自理，就診原因是妻子反復(fù)流產(chǎn)兩次。行143個(gè)核型分析，其中138個(gè)8號染色體三體，僅有5個(gè)核型正常。
鄔教授分享的最后一個(gè)案例是脆性X綜合征（fragile X syndrome），典型的臨床表現(xiàn)為臉長，耳朵大，巨睪丸，智力障礙等。下圖及表展示了其遺傳病理學(xué)。
如上表所示，CGG重復(fù)數(shù)在正常人為5-44次；當(dāng)重復(fù)達(dá)到55-200次，其轉(zhuǎn)錄增加，翻譯減少，女性表現(xiàn)為卵巢早衰， 男性50歲左右會共濟(jì)失調(diào)和震顫；當(dāng)重復(fù)達(dá)到200以上，基因上游CpG島會甲基化，導(dǎo)致基因沉默，男性導(dǎo)致智力障礙，女性根據(jù)X染色體失活比例不同，有些成為攜帶者而表型正常，有些表型為脆性X綜合征。
脆性X綜合征中，超過95%是由于CGG重復(fù)擴(kuò)展的動態(tài)突變和異常甲基化而導(dǎo)致的FMRP蛋白合成減少或缺失所致；不到5%是由于FMR1基因的缺失突變或點(diǎn)突變而導(dǎo)致FMRP蛋白功能異常而致?。贿€有12-41%的患者存在嵌合。
綜合以上情況，下表展示了脆性X綜合征的檢測策略?？梢钥闯?，在檢測策略中，用熒光PCR作為篩查手段，產(chǎn)前診斷用Southern基因組印記，原因是CG之間有三個(gè)氫鍵，導(dǎo)致其連接緊密，因此CG含量高PCR擴(kuò)增難，而脆性X綜合征的診斷需要把大片段的CGG重復(fù)擴(kuò)增出來，PCR檢測常只有存在短片段擴(kuò)增的優(yōu)勢擴(kuò)增，長的擴(kuò)增不出來，于是會漏掉嵌合狀況。
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