昨天我們已經給大家通俗地介紹了一下 2019 年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，可戳下方藍字回顧。
漫畫解讀：2019 諾貝爾生理學獎：面對缺氧，懂得 " 垃圾分類 " 的細胞才是好細胞
搞清楚缺氧時細胞里發(fā)生的事，能幫我們治療貧血和癌癥
今天，果殼繼續(xù)帶你深入了解細胞是怎樣感知并適應環(huán)境氧含量的。
2019 年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予了小威廉 · G · 凱林（William G. Kaelin Jr.）、彼得 · J · 拉特克利夫爵士（Sir Peter J. Ratcliffe）和格雷格 · 塞門扎（Gregg L. Semenza）。自現(xiàn)代生物學問世以來，人們便已經了解生命需要用氧氣來維持這一事實。然而，通過此次獲獎的研究，我們才第一次知道了細胞適應氧氣供應變化的分子機制。
當動物細胞周圍的氧氣水平發(fā)生變化時，其基因表達就會發(fā)生根本性的變化?；虮磉_的這些變化會改變細胞代謝，造成組織重建，甚至導致心率和通氣量增加等機體反應。
在 20 世紀 90 年代初期的研究中，格雷格 · 塞門扎發(fā)現(xiàn)了一種調節(jié)這些氧依賴性反應的轉錄因子，并在 1995 年純化和克隆了它。他將這種因子稱為 HIF，即缺氧誘導因子（Hypoxia Inducible Factor），并證明它由兩個部分組成：一個是新發(fā)現(xiàn)的，對氧氣敏感的部分，HIF-1 α；另一個是先前已知的，恒常表達且不受氧調節(jié)的蛋白 ARNT。小威廉 · G · 凱林于 1995 年起從事希佩爾 - 林道綜合征（VHL，von Hipple-Lindau）腫瘤抑制基因的研究，分離出該基因的第一個全長克隆后，他證明，該基因可以抑制 VHL 突變致瘤細胞系中的腫瘤生長。此后，拉特克利夫爵士于 1999 年證明了VHL 和 HIF-1 α 之間存在相互作用，且 VHL 調節(jié)了 HIF-1 α 的翻譯后和對氧敏感的降解。最后，凱林和拉特克利夫爵士的研究組同時發(fā)現(xiàn)，VHL 對 HIF-1 α 的調節(jié)取決于 HIF-1 α 的羥基化，這是一種共價修飾，其本身依賴于氧。
三位獲獎者的共同努力證明，基因表達對氧變化的反應與動物細胞中的氧水平直接相關，這使得機體能夠通過 HIF 轉錄因子的作用，立即發(fā)生細胞反應以適應氧合作用。
氧氣與動物的生命
18 世紀 70 年代初期，瑞典科學家卡爾 · 舍勒（Carl Scheele）根據(jù)計算發(fā)現(xiàn)，大約有四分之一的空氣是他所說的 " 火氣 "，也就是大氣中能讓物質燃燒的成分。這一發(fā)現(xiàn)最終于 1777 年發(fā)表?；旧显谕粫r間的英格蘭，約瑟夫 · 普里斯特利（Joseph Priestley）也找到了一種凈化這種以前未知的氣體的方法，他稱其為 " 脫燃素空氣 "。同一時間，安托萬 · 拉瓦錫（Antoine Lavoisier）在巴黎進行了分離該物質的實驗，并且賦予了它我們今天所熟知的名字：氧氣。
氧氣對于動物的生命是必需的，氧化反應利用氧氣使食物中的營養(yǎng)物質轉化為腺苷三磷酸（ATP）。確實，根據(jù)可利用的氧氣量校準細胞條件是控制代謝的關鍵。早在一個多世紀前，人們就已經發(fā)現(xiàn)了這一點，例如，1858 年，路易 · 巴斯德（Louis Pasteur）第一個證明動物細胞中氧氣的使用存在復雜的平衡，并且細胞使用多種途徑來完成能量轉換。75 年以前，曾有兩項諾貝爾獎與動物的氧感知機制有關：1931 年，奧托 · 沃伯格（Otto Warburg）因其發(fā)現(xiàn)涉及細胞呼吸的酶促基礎而獲獎；1938 年，柯奈爾 · 海門斯（Corneille Heymans）發(fā)現(xiàn)了神經系統(tǒng)在對氧氣的呼吸反應中的作用。然而，在整個 20 世紀的大部分時間里，人們都還不清楚在基因表達的水平上，機體是如何調節(jié)對氧通量的適應性的。
對氧氣變化的適應性
在幾乎所有的動物細胞里，快速應對和適應氧含量變化的能力都是非常必要的。關于演化過程的分子分類學研究清楚表明，當細胞開始將自身組織成多細胞的三維結構時，這種應對氧通量變化的反應，就不再只是單個細胞內代謝適應的自主反應，它還讓復雜的生理反應得以發(fā)展。細胞需要通過許多自主性途徑來適應氧氣水平的變化，尤其是通過調節(jié)自身的代謝速率。當從組織與器官水平檢查這種反應時，科學家發(fā)現(xiàn)，多細胞生物需要重塑組織，以適應變化了的氧氣水平（例如在創(chuàng)傷后重新構建脈管系統(tǒng)）；也需要調整整個生物體，以補償氧合作用的變化（例如，運動或者處于高海拔時，通氣反應會增加）。
舉個例子：當人處于高海拔時，腎臟中有專門的細胞能夠感受血液中氧氣水平的變化，從而制造和釋放促紅細胞生成素（EPO）。這種激素可以激活骨髓中的紅細胞合成。紅細胞濃度增加能夠幫助我們適應于更低的氧氣分壓。
動物可能會暴露于低氧環(huán)境，但重要的是，氧氣水平在組織中也各不相同。動物組織中的氧氣水平在空間上和時間上都有變化；并且，不論是正常的生理事件（例如，骨骼肌用力時，可用的氧氣量降低），還是像癌癥及感染這樣的病理過程，這種變化都會發(fā)生。20 世紀七八十年代的研究清楚表明，這些局部的、暫時的氧氣分壓變化，通過改變基因轉錄，調節(jié)細胞和組織中重要的適應反應。這些基因調節(jié)反應能夠改變細胞代謝，并且控制基礎的發(fā)育、再生、防御過程，包括血管生成、炎癥等許多個方面。
動物細胞感知不同氧氣濃度的能力，以及隨之而來的對基因表達模式的重塑，對于幾乎所有動物的生存都至關重要。由這些途徑所控制的氧氣激活信號通路，能夠影響至少 300 個分布于各種各樣調控網絡中的基因。這些分子通路滲透于眾多的生理過程之中，從器官發(fā)育和代謝穩(wěn)態(tài)，到組織再生和免疫，范圍極廣；并且，這些通路在許多疾病中都扮演了重要的角色，包括癌癥。
氧氣與紅細胞的生成反應
任何對動物生命具有深遠意義的信號通路，幾乎必定會涉及許多層次的精細調節(jié)，也必定會擁有許多與其他分子通路的交叉點，氧反應通路也不例外。因此意料之中的是，此次獲獎成果在當年發(fā)表之后，關于氧反應調控的分子細節(jié)也并未就此完結。相反，這幾個關鍵發(fā)現(xiàn)打開了整個領域的局面，導致了相關工作的爆炸性發(fā)展，揭示了氧通量反應背后的巨大而復雜的分子機制。
三位諾獎獲得者的基本發(fā)現(xiàn)，都是圍繞著缺氧誘導因子（HIF）轉錄因子的作用展開的。這個因子的發(fā)現(xiàn)起源于 1986 年至 1987 年間許多人的工作，他們發(fā)現(xiàn)，缺氧導致腎臟中的促紅細胞生成素（EPO）轉錄表達增加。而這一發(fā)現(xiàn)的根源又可以往上追溯到 1882 年，法國生理學家保羅 · 伯特（Paul Bert）首次證明了缺氧會產生心血管效應，也首次證明，暴露在高海拔環(huán)境會增加紅細胞數(shù)量。
缺氧誘導分子的分離
一旦人們意識到 EPO 基因會被缺氧誘導出轉錄反應，下一步就是確定 EPO 基因調控區(qū)中對氧敏感的 DNA 序列是哪一段。格雷格 · 塞門扎決定用轉基因小鼠來尋找 EPO 基因的轉錄調控元件，將人 EPO 基因周圍不同長短的 DNA 片段克隆進小鼠體內。他和同事首先證明，一個包含 EPO 編碼序列在內的 4000 堿基對區(qū)域，再加上 5' 和 3' 兩端的一些短的側翼序列，能導致所有轉進這些基因的組織生產 EPO，并引起 EPO 增加，從而引發(fā)紅細胞增多癥。他們接下來又證明，一個更長的 EPO 基因結構，其 5' 端有 6000 堿基對的側翼序列，能在腎臟中誘導 EPO 表達。這項研究指出，EPO 對氧氣的反應受到復雜的轉錄調控，其中有正調節(jié)因子，也有負調節(jié)因子。
僅僅一年后，在 1991 年，塞門扎就發(fā)表了另外兩項研究，增加了關于 EPO 基因調控的重要信息。（1）一項 DNA 水解酶超敏區(qū)域的研究找到了 EPO 基因 3' 端的側翼序列中的一個小區(qū)域，該區(qū)域能結合多個核因子，至少有兩個核因子能被貧血在肝臟和腎臟中誘導產生；在體外瞬時表達試驗中，同樣是這個小區(qū)域起著缺氧誘導增強因子的作用。（2）另一項研究進一步確定了 EPO 在轉基因模型中的轉錄調控。大約在同一時間，彼得 · J · 拉特克利夫爵士和杰米 · 卡羅（Jaime Caro）的實驗室的工作表明，EPO 基因的 3' 端存在著起順式作用的 DNA 元件，該元件轉染體外培養(yǎng)的肝癌細胞后，能賦予細胞感受氧氣的能力。
上面所說的研究工作指引塞門扎在 1992 年鑒定出了 EPO 基因 3 端上一段大約有 50 個堿基對的增強子，在體外培養(yǎng)的細胞中，它可以用來誘導缺氧誘導報告基因的表達。這個增強子，塞門扎稱之為缺氧反應元件（HRE），它可結合肝癌細胞中的數(shù)種核因子：一個是非誘導性的，另一個則與低氧環(huán)境有關。因此，后面的一種因子被塞門扎稱為" 缺氧誘導因子 "（HIF）。
拉特克利夫與塞門扎證實，EPO 基因 3 ’端的增強子在很多種類的哺乳動物細胞中都可以驅動缺氧誘導的報告基因表達。這表明，EPO 基因相關的供氧調節(jié)背后的分子機制在各種各樣的細胞中都很活躍，這一發(fā)現(xiàn)展現(xiàn)了這種新因子可能是氧含量感知共同的細胞機制中的一部分。
缺氧誘導 HIF 的過程可以在很多類型的哺乳動物細胞中觀察到，而不僅僅是腎臟和肝臟中那些產生促紅細胞生成素的細胞。這一點讓很多科學家產生了興趣。HIF 的發(fā)現(xiàn)提示，代謝適應和響應含氧量變化的組織重構背后可能存在一個通用的分子機制。
此時，塞門扎采取生物化學方法從大量細胞提取物中純化了這個蛋白質。作為純化過程中的功能測定，他用 " 電移位切試驗 " 測試了 EPO 基因 3 ’端的增強子。純化蛋白的氨基酸序列分析以及隨后的 cDNA 克隆顯示，HIF 自身是異源二聚體，由兩個不同基因的產物組成。其中第一個成分是 HIF 因子對氧敏感的部分，被塞門扎命名為 HIF-1 α；第二部分來自一個恒常表達的基因，一開始它被稱為 HIF-1b，直到證據(jù)顯示這個成分其實此前就已經被克隆和描述過，它叫芳香烴受體核轉位因子（ARNT）。ARNT 蛋白可與其他數(shù)種因子結合，而且鑒于它的表達與氧含量無關，很快科學家們便確定 HIF-1 α 是調節(jié) HIF 氧含量反應性的關鍵。
HIF 家族擴張
一個與 HIF-1 α 高度關聯(lián)的蛋白于 1997 年被 4 個不同研究組獨立克隆出來；一開始它有好幾個名字，包括至今仍在普遍使用的 HIF-2 α。不過這個基因的正式定名是 EPAS1。EPAS1 基因編碼一個與 HIF-1 α 有高水平序列同源性的蛋白，并也作為異質二聚體和 ARNT 結合。它同樣有 HIF-1 α 對低氧條件的敏感性，并且本質上和下述 HIF-1 α 有所有相同的調控模式。
然而 HIF-1 α 和 EPAS1 在功能上有重要差異。刪除 HIF-1 α 的小鼠引發(fā)了一個明確表型（妊娠中期致死），但刪除 Epas1 基因則會引發(fā)多種不同表型，可能是因為遺傳背景不同。此外，大量證據(jù)表明，有些低氧響應機制是由二者之一單獨控制的；例如，紅細胞生成主要是由 EPAS1 控制的。
HIF 調節(jié)是轉錄后調節(jié)，且 VHL 參與其中
包括拉特克利夫團隊在內，多個實驗室獲得的數(shù)據(jù)表明，HIF-1 α 自身的水平是通過改變蛋白質穩(wěn)定性實現(xiàn)的，而非通過基因轉錄改變或蛋白質合成。多個研究組進一步揭示，HIF-1 α 通過泛素 - 蛋白酶通路降解，這一方式是氧依賴的。這一工作還發(fā)現(xiàn)了 HIF-1 α 的特定結構域是其氧依賴降解的原因（這個結構域簡稱 ODD 區(qū)，在 HIF-1 α 和 EPAS1 中均有表達）。
大圖模式 當氧含量低（缺氧）的時候，HIF-1 α 被保護住不會降解，并在細胞核里聚集。它和 ARNT 相作用，并結合到特定 DNA 序列的缺氧調控基因（HRE）上（1）。在正常的氧氣水平下，HIF-1 α 會由蛋白酶體快速降解（2）。氧氣通過為 HIF-1 α 增加羥基（OH）調控了這一降解過程（3）。然后 VHL 蛋白就可以識別 HIF-1 α 并組成一個復合體，根據(jù)氧氣濃度決定是否使它降解。丨諾貝爾獎官網
大約此時—— 1995 年，凱林團隊發(fā)表了第一個 VHL 腫瘤抑制基因的全長序列/strong>，并證明將一個野生型 VHL 轉入一個腎癌細胞系能阻止細胞系形成腫瘤。凱林和許多其他研究組研究了 VHL 基因及其與家族癌癥易感性的關聯(lián)。凱林的論文表明，VHL 是一種癌癥抑制基因，激活這個基因可抑制 VHL 突變患者的腫瘤生長。1996 年，在描述 VHL 基因的過程中，凱林和馬克 · 戈德伯格（Mark Goldberg）研究組合作證明，多個 HIF 靶向基因在 VHL 突變細胞系中過表達。這一發(fā)現(xiàn)表明，兩種通路（HIF 響應和 VHL 相關腫瘤發(fā)生）以某種形式相關。
下一個和 VHL 功能相關的重要線索是識別出 VHL 蛋白的結合伴侶。凱林小組和其他研究者在 1995 年發(fā)現(xiàn)，VHL 能和轉錄延伸因子 B 和 C 相互作用。1997 年，有科學家發(fā)現(xiàn)，VHL 是一個復合物的成分，該復合物里還有 Cul-2 蛋白——蛋白質泛素化的一個重要因子。這一發(fā)現(xiàn)之后被凱林復現(xiàn)。由于延伸因子 C 和 Cul-2 在結構上和 Skp1、Cdc53 有相似之處，而后兩者都已知會針對特定蛋白質造成泛素相關的蛋白質降解，因此這些發(fā)現(xiàn)顯示出了 VHL 和蛋白質降解之間的可能聯(lián)系。
VHL 導致 HIF 成為泛素化和降解的目標
1996~1998 年間，人們明確知道了 HIF-1 α 和 EPAS1 在正常氧濃度下會經由蛋白酶體降解迅速消滅。但是仍然不知道為什么在缺氧條件下這一降解過程會被抑制。拼圖缺失的一塊在于標記 HIF-1 α 降解的泛素 E3 連接酶。在這個問題上，拉特克利夫等人于 1999 年作出了關鍵的突破，在一篇里程碑式的論文里，他們表明，VHL 復合物和 HIF-1 α 的降解相關。接下來，他們和其他人表明，VHL 在這一過程中是泛素 E3 連接酶復合物的識別成分。
拼圖最后的重要一片是VHL 和 HIF-1 α 的反應以及下一步的 HIF-1 α 分解如何受氧氣調控。重要的是，1999 年的一篇論文指出，VHL 和 HIF-1 α 反應需要有氧和鐵存在。這一發(fā)現(xiàn)開啟了對反應機理的搜索：一方面是 HIF-1 α 要經過怎樣的需要氧的化學修飾，才能讓 VHL 結合上去；另一方面是什么酶能催化這一反應。當時，已知在膠原蛋白中會出現(xiàn)需要氧氣的蛋白羥基化，并已知受到膠原蛋白脯氨酸 -4 羥基化酶調控。因此，人們懷疑 HIF-1 α 中脯氨酸基團的羥基化這一需要氧的反應可能會帶來 VHL 結合所需的構象變化。事實也證明如此。2001 年，拉特克利夫和凱林的實驗室同時匯報，HIF-1 α 的 ODD 結構域中兩個脯氨酸基團的 4- 羥基化這一需氧反應增加了 VHL 復合物對 HIF 轉錄因子的親和度。這兩篇文章是幾乎同時發(fā)表的。
氧依賴性的開關
脯氨酸羥基化反應需要氧氣，這一事實揭示了 HIF-1 α 和 EPAS1 蛋白質的翻譯后調控機制：缺氧時，不發(fā)生羥基化，VHL 無法辨認 HIF-1 α，因此 HIF-1 α 不會被泛素化，從而避免了被蛋白酶體降解，保持完整。結果 HIF-1 α 得以積累，轉錄激活缺氧誘導的基因 α 程序（見下圖）。
大圖模式 拉特克利夫組和另一個研究組獨立確定了參與羥基化 HIF-1 α 和 EPAS1 的脯氨酰羥化酶（PHD）基因；這些發(fā)表于 2001 年的論文描述了分離 PHD 基因的過程。凱林小組也分離出 PHD 基因，但使用的是生物化學方法，并在 2002 年發(fā)表了這項研究。這些羥化酶的鑒定為制造特殊的 PHD 抑制劑從而增加 HIF 的活性提供了可能性，例如，增加貧血患者的促紅細胞生成素水平。
第二個氧依賴性機制是在 2001 年發(fā)現(xiàn)的，此機制不是為了降解 HIF-1 α，而是為了抑制 HIF-1 α 作為轉錄因子的活性。塞門扎和他的團隊是第一個識別出相關因子的，將其稱為 FIH-1，意思是 " 抑制 HIF 的因子 "。FIH 也是一種氧依賴性的羥化酶，這次是負責羥基化 HIF-1 α 和 EPAS1 的 N- 末端激活域（NTAD）當中的天冬酰胺殘基。有研究者發(fā)現(xiàn)，這種羥化作用能干擾 p300 轉錄輔助激活因子的募集。這樣，氧不僅通過其氧依賴降解域的脯氨酰羥基化促進了 HIF-1 α 降解，如果有 HIF-1 α 或 EPAS1 躲開了依賴 VHL 降解的命運，氧依然能抑制它們的轉錄功能。因此，HIF 活性對于氧依賴性轉錄后抑制不是有一個，而是有兩個獨立的機制。這表明，通過細胞氧水平調節(jié)，保持 HIF 水平的適當性、準確性是非常精細的過程。
HIF 調控通路的廣闊意義
從那以后，許多研究小組的工作顯示了 HIF 通路的堅實作用，以及它在調節(jié)受氧影響的基因表達中的核心地位。自從三位獲獎者最早的開拓性發(fā)現(xiàn)以來，他們一直是這個領域的中心人物。他們參與了 HIF 通路分子生物學的進一步闡明，并增進了我們對缺氧反應在健康和疾病中所起的生理作用的理解。
調節(jié) HIF-1 α 穩(wěn)定性的脯氨酸羥化酶被發(fā)現(xiàn)后，人們就致力于尋找各種能提高 HIF 水平的羥化酶抑制劑 ; 這開辟了一整條藥物發(fā)現(xiàn)的新通路。事實上，一些通過抑制脯氨酸羥化酶來提高 HIF 功能的潛在藥物，已經在臨床試驗中走得相當遠了，最近的一系列論文證明了它們在治療貧血方面的臨床療效。
抑制 HIF 通路，未來也可能有很廣闊的應用。人們設想，有些癌癥是因為 VHL 突變引起，而抑制 HIF 通路或許能成為延緩這些癌癥惡化的手段。其中一種是 EPAS1 功能的特異性阻斷劑，凱林和同事最近報告說，在動物模型中，這能夠減緩 VHL 突變細胞的腫瘤生長。
通過藥物提升 HIF 功能，可能有助于治療一系列疾病，因為 HIF 對許多生理過程都必不可少，比如免疫功能、軟骨形成和傷口愈合。從反面來說，抑制 HIF 功能也有許多應用：HIF 水平的增加可見于許多癌癥以及一些心血管疾病，包括卒中、心臟病發(fā)作和肺部高壓。因此，現(xiàn)在很可能只是本屆諾貝爾獎發(fā)現(xiàn)被應用的開始，因為很明顯的事實是，細胞、組織和生物體對氧氣的反應，是動物所具有的最重要的生理適應之一。
翻譯：八云，麥麥，游識猷，窗敲雨，鐘與氏 darla，antares，木易楊楊
校對：odette Ent
