嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）在治療惡性血液病方面取得了令人矚目的成功，但目前自體CAR-T細胞療法的全身毒性和復雜的制造過程阻礙了其更廣泛的應用。通用型CAR-T細胞已經(jīng)被開發(fā)出來，通過從健康人身上分離和編輯異基因T細胞來簡化生產(chǎn)過程，但異基因CAR-T細胞最近遇到了安全問題，部分臨床試驗被FDA叫停。因此，迫切需要尋找新的方法來克服目前CAR-T細胞療法的障礙。
在小鼠模型中，由裝載CAR基因和基因編輯工具的納米載體誘導的體內(nèi)CAR-T細胞顯示出了治療白血病的效果以及更低的全身毒性。自體T細胞的原位編程避免了異體T細胞的安全問題，并且納米載體的制造更易實現(xiàn)標準化。因此，體內(nèi)誘導的CAR-T細胞有望克服目前CAR-T細胞治療的諸多局限性。
近日，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院吳小艷等人在 Frontiers in Oncology 期刊發(fā)表了題為：In-Vivo Induced CAR-T Cell for the Potential Breakthrough to Overcome the Barriers of Current CAR-T Cell Therapy （體內(nèi)誘導CAR-T細胞有望突破當前CAR-T細胞治療的障礙）的綜述論文。
該論文綜述了CAR結(jié)構(gòu)、基因編輯工具和基因遞送技術(shù)在免疫治療中的應用，以及免疫細胞治療的未來趨勢，有助于設計和開發(fā)新的體內(nèi)原位誘導CAR-T細胞。
嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）是一種新型細胞免疫治療技術(shù)，它將合成受體結(jié)合到T細胞中，用同源靶向配體識別和殺死腫瘤細胞。自美國FDA首次批準CD19靶向的CAR-T細胞療法以來，CAR-T細胞療法在B細胞淋巴瘤患者中表現(xiàn)出了前所未有的治療效果。然而，隨著CAR-T細胞治療的顯著成就，細胞因子釋放綜合征（CRS）、神經(jīng)毒性等許多全身毒性作用也被頻繁報道。
此外，CAR-T細胞復雜的制造過程限制了這種治療方法作為標準臨床治療的廣泛應用。因此，迫切需要開發(fā)一種新型CAR-T細胞范式來克服這些障礙，并讓這種治療方法使更多的患者受益。
為了簡化CAR-T細胞的復雜制造過程，來自健康人的通用異基因CAR-T細胞已在臨床試驗中進行了測試。通用CAR-T細胞可以是現(xiàn)成的，然后像普通藥物一樣注入患者體內(nèi)，而不需要等待從患者體內(nèi)分離出自體T細胞。然而，去年Cellectis公司的通CAR-T療法UCARTCS1A臨床試驗期間的死亡案例引發(fā)了人們對異基因CAR-T細胞安全性的擔憂。出于安全考慮，F(xiàn)DA最近還停止了來自Allogene公司的通用CAR-T細胞的臨床試驗。因此，我們需要新的策略來克服相關(guān)毒性，并簡化當前CAR-T細胞療法的制造過程。
由裝載CAR基因的納米載體和基因編輯工具誘導的體內(nèi)CAR-T細胞對白血病顯示出良好的效果。原位編程自體CAR-T細胞可以增強對腫瘤細胞的靶向殺傷，降低細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性等全身毒性。此外，納米載體可以很容易地以標準化的方法制造。體內(nèi)誘導的CAR-T細胞為克服目前CAR-T細胞治療的障礙提供了一種潛在的解決方案。
本文綜述了CAR結(jié)構(gòu)設計、基因編輯工具、基因遞送系統(tǒng)以及免疫細胞治療的未來趨勢。
CAR結(jié)構(gòu)和進化
嵌合抗原受體（CAR）的結(jié)構(gòu)具有模塊化設計，包括抗原結(jié)合域、鉸鏈、跨膜域和細胞內(nèi)信號域（圖1A）。抗原結(jié)合域通常是由單克隆抗體衍生的單鏈可變片段（scFv）分子，可與惡性癌細胞表面的抗原結(jié)合，跨膜結(jié)構(gòu)域負責將CAR錨定在T細胞膜上。細胞內(nèi)信號域通常包含T細胞受體CD3ζ鏈衍生的T細胞激活域，以及共刺激域，通常由含有CD28或4-1BB區(qū)域的基于酪氨酸的免疫受體激活基序組成（也稱為CD137和TNFRSF9）。CAR結(jié)構(gòu)的每個組成部分的變化能夠微調(diào)最終CAR-T細胞產(chǎn)品的功能和抗腫瘤活性。
各種CAR結(jié)構(gòu)被設計用來提高CAR-T細胞治療的安全性和有效性。一旦設計的CAR基因被整合到T細胞中，T細胞表面的scFv會特異性地識別腫瘤相關(guān)抗原，并將CAR-T細胞與腫瘤細胞結(jié)合。在此之后，CAR-T細胞的細胞內(nèi)信號域被激活，導致CAR-T細胞增殖并分泌殺死腫瘤細胞的細胞因子。
自2011年賓夕法尼亞大學Carl June和費城兒童醫(yī)院David Porter首次將CAR-T細胞應用于臨床治療以來，CAR結(jié)構(gòu)已經(jīng)歷經(jīng)了五代發(fā)展（圖1B）。第一代CAR含有細胞內(nèi)刺激區(qū)和細胞外單鏈抗體，由于缺乏共刺激分子，這一代CAR-T細胞不能持續(xù)增殖。第二代CAR增加了一種共刺激分子，如CD28，或4-1BB（CD137），以增強CAR-T細胞的增殖和降低毒性。Yescarta?和Kymriah?這兩款最早獲批上市的CAR-T細胞療法是分別含有CD28和4-1BB的第二代CAR-T細胞。第三代CAR包括兩個共刺激分子，如CD27、CD28、腫瘤壞死因子超家族4（OX40，也稱為CD134）、4-1BB（CD137）或CD244。第四代CAR被稱為TRUCKs，它結(jié)合了CAR-T細胞的直接抗腫瘤能力和遞送的細胞因子的免疫調(diào)節(jié)功能。TRUCKs已經(jīng)進入早期臨床試驗，使用一系列細胞因子，包括IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23及其組合。第五代則集成了一個額外的膜受體，以抗原依賴的方式控制CAR-T細胞的激活。
圖1A：CAR的基本結(jié)構(gòu)；圖1B：五代CAR的發(fā)展
除了在CAR結(jié)構(gòu)中添加新的功能分子外，許多研究為新的CAR結(jié)構(gòu)選擇了替代的腫瘤靶向位點。CD30在霍奇金淋巴瘤惡性細胞上表達非常強，而在健康淋巴細胞和造血干/祖細胞（HSPC）上表達較弱。CD30 CAR-T細胞療法在CD30+惡性腫瘤的治療中表現(xiàn)出優(yōu)異的效果，而健康活化淋巴細胞和HSPC則不受影響。CD20是一種33-37-kDa的非糖基化跨膜磷酸化蛋白，有助于B細胞的發(fā)育和分化，CD20在晚期pre-B細胞和成熟B細胞中高表達，但在熱休克細胞表面不表達。CD20 CAR-T細胞療法在b細胞非霍奇金淋巴瘤的治療中已顯示出前景，目前正被考慮用于復發(fā)或難治性CD20陽性慢性淋巴細胞白血病患者。Lym-1靶向人B細胞淋巴瘤表面的人白細胞抗原D-相關(guān)抗原（HLA-DRs）的構(gòu)象表位。Lym-1與惡性B細胞的結(jié)合親和力高于正常B細胞，Lym-1 CAR-T細胞對B細胞淋巴瘤表現(xiàn)出強大的抗腫瘤作用。一些替代的靶向位點與CD19結(jié)合形成雙靶點CAR-T細胞。例如，將CD37和CD19結(jié)合到一個CAR中，生成能夠單獨或同時識別CD19和CD37的雙特異性CAR-T細胞。CD79b也是CD19的一個補充靶向位點。CD19和CD79雙特異性CAR-T細胞阻止了B細胞淋巴瘤從CD19 CAR-T細胞逃逸。一些替代的靶向位點具有聯(lián)合靶向功能，作用于腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境。例如，CD123在霍奇金淋巴瘤細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞中都有表達，因此抗CD123的CAR-T細胞可以共同靶向這兩種細胞并同時殺死它們。CAR結(jié)構(gòu)在不斷進化，以提高目前CAR-T細胞療法的療效。
當前CAR-T細胞療法的障礙
從2017年到2021年，F(xiàn)DA已經(jīng)批準了5款CAR-T細胞治療產(chǎn)品上市，如表下表所示。
FDA批準的5款CAR-T細胞治療產(chǎn)品
Kymriah?（Tisagenlecleucel）是首個被FDA批準用于某些類型B細胞淋巴瘤成人患者的CAR-T細胞療法。三種已獲批的CAR-T細胞產(chǎn)品Yescarta?（Axicabtagene ciloleucel）、TecartusE?（Brexucabtagene autoleucel）和Breyanzi?（Lisocabtagene maraleucel）也被批準用于B細胞淋巴瘤的治療。第五種CAR-T細胞產(chǎn)品Abecma?（Idecabtagene vicleucel）用于多發(fā)性骨髓瘤治療。
除了已獲批準的5種CAR-T細胞產(chǎn)品外，還有大量的CAR-T細胞正在臨床試驗中進行研究，但目前的CAR-T療法存在一些障礙，如相關(guān)毒性、免疫抑制腫瘤微環(huán)境和復雜的制造工藝，這些障礙阻礙了CAR-T療法的更廣泛應用。
目前CAR-T治療相關(guān)的主要毒性包括細胞因子釋放綜合征（CRS，也稱為細胞因子風暴）、免疫效應細胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）和非腫瘤靶向毒性。CRS是由CAR-T細胞治療后產(chǎn)生大量炎癥細胞因子引起的，如IL-6、IL-10、IL-2和TNFα。CRS常引起發(fā)熱、低血壓、缺氧、器官功能障礙，甚至危及生命的不良反應。嚴重或危及生命的CRS發(fā)生率可達25%。ICANS是與CAR-T細胞治療相關(guān)的另一種常見毒性，其特征是神經(jīng)異常和后遺癥，通常在CAR-T細胞治療后1周內(nèi)發(fā)生。ICANS引起的常見不良反應包括中毒性腦病伴失語、思維混亂和找詞困難
非腫瘤靶向毒性是由于靶向蛋白在正常和惡性細胞上均有表達，例如，在惡性B細胞患者給予CD19 CAR-T細胞時，由于CD19 CAR-T細胞根除CD19+B細胞祖細胞，非腫瘤靶向效應將導致B細胞再生障礙性發(fā)育，并導致低γ球蛋白血癥。
免疫抑制腫瘤微環(huán)境（MVT）抑制CAR-T細胞的活化，加速T細胞耗竭，免疫抑制MVT的不利因素包括缺氧、多種免疫抑制細胞、共抑制受體的持續(xù)表達。缺氧的定義是腫瘤MVT中缺氧。腫瘤MVT中的免疫抑制細胞包括調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）和髓源性抑制細胞（MDSCs）。
目前CAR-T細胞的制造過程是一項非常復雜的工作，包括T細胞的收集、基因修飾和擴增，以及輸注回患者體內(nèi)，這些多步驟的技術(shù)和物流運輸充滿了風險。此外，長期和個性化的制造過程對建立標準操作程序提出了巨大的挑戰(zhàn)。目前CAR-T細胞的制造過程昂貴且技術(shù)密集，這使得許多需要這種新療法的癌癥患者難以獲取。
CAR-T細胞治療中的基因編輯工具
CAR-T細胞治療中常用的基因編輯工具包括ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9技術(shù)。ZFN是第一代廣泛應用的基因編輯工具，可以實現(xiàn)有效、特異的基因編輯，但優(yōu)化目標蛋白分子耗時較長。TALEN作為第二代基因編輯工具，比ZFN更經(jīng)濟，但仍需要較長的時間來優(yōu)化系統(tǒng)。而CRISPR-Cas9技術(shù)因其簡單、高效和特異性成為最受歡迎的基因編輯工具。
以CRISPR-Cas9為代表的基因編輯技術(shù)的發(fā)展，使得CAR-T細胞的精確基因編輯能夠通過去除T細胞的PD-1來生成抗耗竭T細胞。CRISPR-Cas9也被用于敲除正常細胞中的內(nèi)源性抗原，如CD33和CD7，以減少重定向T細胞的非腫瘤靶向毒性。
目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)已用于至少21種靶抗原的CAR-T臨床試驗，其中CD19和BCMA這兩個靶點占據(jù)了近一半。為了更廣泛地使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來編輯CAR-T細胞，必須開發(fā)有效的遞送方法。
使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的CAR-T細胞治療的靶向抗原，數(shù)據(jù)截至2021年6月，僅統(tǒng)計在在美國注冊的臨床試驗
基因遞送系統(tǒng)
目前已有多個不同遞送系統(tǒng)被用于遞送基因治療產(chǎn)品，包括遞送基因編輯工具和CAR基因。例如各種病毒載體和非病毒載體。
用于基因遞送的病毒載體和非病毒載體的分類及占比情況
病毒載體具有最高的轉(zhuǎn)染效率，被廣泛應用于基因遞送，但其存在免疫原性和細胞毒性等問題。腺相關(guān)病毒（AAV）比其他病毒載體（例如慢病毒和腺病毒）具有較低的毒性風險，然而，AAV載體比其他病毒載體的裝載尺寸更小，只能遞送不足5kb的DNA片段。
除了病毒載體外，還有非病毒遞送系統(tǒng)，非病毒傳遞系統(tǒng)可以分為物理技術(shù)和化學技術(shù)兩大類。物理技術(shù)包括電穿孔、針注射、激光輻照和基因槍。電穿孔是應用最廣泛的基因遞送方法之一，它利用電脈沖誘導細胞膜上的孔隙形成和基因的瞬時滲透性。物理技術(shù)由于免疫原性較低，成為一種有吸引力的基因遞送方法，但這種方法不能靶向內(nèi)臟器官。用于基因遞送的化學技術(shù)主要包括陽離子脂質(zhì)或基于聚合物的納米顆粒、金納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、碳納米管、外泌體、鐵蛋白、細胞質(zhì)膜等等。
基于脂質(zhì)的納米顆粒是最具吸引力的非病毒基因遞送載體之一，這些載體已經(jīng)幾種配方被批準用于臨床。特別是脂質(zhì)納米顆粒（LNP）被成功用于遞送mRNA新冠疫苗。LNP也被用于遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)，在臨床試驗中實現(xiàn)了有效的基因編輯和治療效果。基于聚合物的納米顆粒是另一種適合基因遞送系統(tǒng)，帶正電的聚合物可以與破壞細胞膜并使內(nèi)體逃逸的基因形成穩(wěn)定的多聚體?；诰酆衔锏募{米顆粒的局限性在于其正電荷表面與血液循環(huán)中的負電荷細胞膜和蛋白質(zhì)相互作用導致的毒性和免疫原性。
外泌體是天然分泌的納米尺寸的細胞外囊泡，由于其天然的生物相容性和最小的免疫清除，正被廣泛研究作為基因遞送載體。但是將外泌體作為基因遞送載體，還要克服生產(chǎn)、分離和提純方面的困難，目前還面臨著諸多挑戰(zhàn)。來自血小板、紅細胞的細胞質(zhì)膜是用于基因遞送的仿生載體，具有天然的生物相容性和靶向性，但其轉(zhuǎn)染效率有待提高。其他化學納米載體都具有一些自己的特性，決定了它們對基因遞送的影響。一些已經(jīng)顯示出治療多種疾病的潛在效果，但最佳的給藥系統(tǒng)仍未實現(xiàn)臨床應用。
體內(nèi)CAR-T細胞誘導
目前CAR-T細胞的制造過程需要專門的設備和大量的技術(shù)積累，而且是勞動密集型和耗時的，限制了這項技術(shù)在全球范圍內(nèi)的廣泛應用，并推高了CAR-T細胞療法的價格，使許多患者無法負擔。
為了簡化生產(chǎn)過程，來自異體健康人的通用型CAR-T細胞已在臨床試驗中進行了測試，但是，由于對異體CAR-T細胞的安全性擔憂，F(xiàn)DA最近暫停了來自異體基因的通用型CAR-T細胞的臨床試驗。因此，迫切需要開發(fā)一種安全、簡單的CAR-T細胞生產(chǎn)工藝。
通過納米顆粒在體內(nèi)對CAR-T細胞進行編程是簡化和標準化體外CAR-T細胞復雜制造過程的一種優(yōu)雅而新穎的方法。此外，CAR-T細胞的原位誘導可有效降低細胞因子釋放綜合征（CRS）、免疫效應細胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）等全身毒性。
早在2017年和2020年，美國Fred Hutchinson癌癥研究中心的 Matthias Stephan 教授就曾先后在 Nature Nanotechnology 和 Nature Communications 期刊發(fā)表論文【2、3】。通過納米載體遞送CAR-DNA或CAR-mRNA實現(xiàn)體內(nèi)誘導CAR-T細胞。在這兩項工作中，納米遞送系統(tǒng)的核心由陽離子聚合物聚(β-氨基酯)構(gòu)成，并與靶向CD19的第二代CAR結(jié)構(gòu)組裝。納米遞送系統(tǒng)的外部由聚谷氨酸（PGA）與抗CD3抗體綴合而成。攜帶CD19特異性CAR基因的聚合物納米顆粒在體內(nèi)快速和特異性編輯T細胞，并帶來了與傳統(tǒng)實驗室制造的CAR-T細胞相當?shù)目鼓[瘤效果，而不會引起全身毒性。
Christian Buchholz 等人首次報道了用第二代抗CD19-CAR基因包裹的慢病毒在免疫缺陷NOD-scid-IL2Rc null（NSG）小鼠中原位誘導CAR-T細胞，并顯示出抗腫瘤活性。在他們的研究中，意外檢測到CAR陽性的NK和NKT細胞，這可能是由于慢病毒載體的非特異性造成的。
為了克服病毒載體的非特異性，Samuel K Lai等人開發(fā)了一種雙特異性結(jié)合劑，將慢病毒載體重定向到T細胞，用于CAR-T細胞的體內(nèi)特異性工程。他們觀察到由慢病毒改造的體內(nèi)CAR-T細胞具有抗腫瘤活性，但表達CAR的T細胞數(shù)量相對較少。他們認為這證明了一個有價值的、未經(jīng)證實的理論，即與離體CAR-T細胞相比，體內(nèi)CAR-T細胞具有更好的性能和自我更新能力。
在病毒載體中，腺相關(guān)病毒（AAV）的毒性風險較低，2021年3月，南京大學醫(yī)學院吳喜林等人在 Blood Cancer Journal 期刊發(fā)表論文【4】，報道了AAV編碼第三代CAR基因可以充分重編程免疫效應細胞產(chǎn)生體內(nèi)CAR-T細胞。在這項工作中，他們證明了AAV在體內(nèi)誘導CAR-T細胞的概念，但他們也表示了對攜帶CAR基因的AAV的非特異性的擔憂。除了病毒載體的非特異性外，病毒載體的另一個普遍擔憂的安全問題是其可能導致基因在染色體中的隨機插入。
精確快速的基因編輯工具如CRISPR已被廣泛用于生成體外CAR-T細胞。利用CRISPR進行體內(nèi)基因編輯的研究很多，但目前還沒有應用CRISPR生成體內(nèi)CAR-T細胞的報道。結(jié)合基因編輯工具和CAR基因的未來應用將加速體內(nèi)CAR-T細胞的臨床應用。
納米載體遞送設計的CAR-結(jié)構(gòu)和基因編輯工具可以誘導具有多種功能的CAR-T細胞在體內(nèi)形成，以克服當前CAR-T細胞的障礙，如相關(guān)毒性作用、免疫抑制微環(huán)境和復雜的制造過程。
全身毒性作用可以通過腫瘤原位編輯和T細胞的擴增來降低。在CAR結(jié)構(gòu)中加入特殊的細胞因子基因，使CAR-T細胞能夠分泌細胞因子，改善免疫抑制微環(huán)境，使其適合T細胞的生存和增殖。將CAR結(jié)構(gòu)的基因編輯工具加載到納米顆粒中，可以敲除免疫檢查點基因，從而逆轉(zhuǎn)T細胞耗竭。更重要的是，該方法解決了體外CAR-T細胞制造工藝標準化和規(guī)模化的難題。最終，通過納米遞送載體可以方便地生產(chǎn)、儲存和作為常規(guī)藥物的CAR-T細胞治療產(chǎn)品。
體外生成CAR-T與基于納米遞送系統(tǒng)的體內(nèi)生成CAR-T的比較
上述這些研究只是體內(nèi)原位誘導CAR-T細胞的開始，要想實現(xiàn)臨床應用，還需要更多的努力來監(jiān)測T細胞在體內(nèi)的編輯和擴增狀態(tài)。
結(jié)論與展望
在過去的十年中，CAR-T細胞治療取得了巨大成就，已有五種CAR-T細胞產(chǎn)品已獲得FDA批準上市。然而，目前的CAR-T細胞療法也有一些需要克服的障礙，如CRS和ICANS的毒性以及昂貴和復雜的生產(chǎn)制造程序。通過裝載CAR基因的納米顆粒和基因編輯工具在體內(nèi)誘導CAR-T細胞，已經(jīng)顯示出克服當前CAR-T細胞療法障礙的潛在突破。
盡管很少有研究報道納米顆粒誘導的體內(nèi)CAR-T細胞，但可靠的臨床前數(shù)據(jù)預測了通過納米遞送方法進行細胞治療的未來前景。體內(nèi)誘導CAR-T細胞治療領(lǐng)域仍處于起步階段，將這種方法轉(zhuǎn)化為臨床實踐同樣面臨許多挑戰(zhàn)。系統(tǒng)總結(jié)用于體內(nèi)誘導CAR-T細胞的納米遞送系統(tǒng)可以指導納米顆粒及其負載物的設計，以優(yōu)化其功效。
綜上所述，體內(nèi)誘導CAR-T細胞有望取代當前的CAR-T細胞療法，成為治療癌癥的標準免疫細胞療法。
