功能性消化不良是臨床常見的一種功能性胃腸疾病，是指經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)檢查后未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性疾病而無法解釋的消化不良的統(tǒng)稱，該病嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量。
健脾扶正顆粒為瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院的制劑，該方由太子參、黃芪、茯苓等9味中藥材組成，方中諸藥緊扣脾胃虛弱，氣機(jī)阻滯，升降失司這一基本病機(jī)，臨床常用于功能性消化不良癥。
其中太子參益氣健脾、生津潤(rùn)肺。
黃芪補(bǔ)氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血，主要成分為黃芪甲苷、毛蕊異黃酮糖苷、芒柄花素，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)證明其有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤，促進(jìn)胃排空的作用。
茯苓利水滲濕、健脾寧心，所含的成分茯苓酸被認(rèn)為能抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠。
桔梗宣肺化痰、利咽排膿，桔梗皂苷D是其中含量相對(duì)較高的一種成分，在抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面均表現(xiàn)出良好的藥理活性。
五味子益氣生津、補(bǔ)腎寧心，其中五味子醇甲可改善腹瀉，加強(qiáng)免疫等多重功效。
該方在瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院經(jīng)過數(shù)千例臨床應(yīng)用，療效確切，制成的顆粒劑更加方便患者的攜帶。
本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)15批健脾扶正顆粒樣品，建立其HPLC指紋圖譜，并對(duì)復(fù)方中的8種指標(biāo)性成分進(jìn)行了含量測(cè)定，為該制劑的臨床用藥提供了保障。
1260InfinityLC高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；WatersArc-2-型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)沃特世公司），ME204E型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）公司]。
WatersSunfireC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm)，DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）。
SB25-12DT型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。
健脾扶正顆粒（瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方），批號(hào)200505、200614、200714、200903、201110、210108、210208、210314、210419、210610、210725、211116、211117、220108、220109(S1～S15），黃芪甲苷對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)PS012327）、毛蕊異黃酮糖苷對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)PS000687）、芒柄花素對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)PS000674）、桔梗皂苷對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)PS010786）、五味子醇甲對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)PS011670）、茯苓酸對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)PS011828）、太子參環(huán)肽B對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)PS000879）、葫蘆巴堿對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)PS012765）均購自成都普思生物科技股份有限公司，乙腈、磷酸為色譜純，水為怡寶水，其他試劑為分析純。
取黃芪甲苷、毛蕊異黃酮糖苷、芒柄花素、桔梗皂苷D、五味子醇甲、茯苓酸、太子參環(huán)肽B、葫蘆巴堿對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每毫升含0.38mg、0.46mg、0.84mg、0.48mg、0.97mg、0.88mg、0.58mg、0.90mg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22μm微孔濾膜濾過，即得。
取健脾扶正顆粒約取6g，精密稱定，研磨至細(xì)粉，過篩（6號(hào)篩），置500mL圓底燒瓶中，加入80%甲醇150mL加熱回流3h，蒸干提取液，殘?jiān)?50mL水溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次50mL，合并萃取液，蒸干，加80%甲醇25mL溶解，搖勻稱定，用80%甲醇補(bǔ)足，經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。
單味藥材溶液的制備分別取處方量的各藥材，精密稱定，打成粗粉，過篩（2號(hào)篩），分別加入甲醇50mL放入100mL錐形瓶中，超聲提取40min后用甲醇補(bǔ)足，經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。
分別取毛蕊異黃酮糖苷、芒柄花素、五味子醇甲、茯苓酸、太子參環(huán)肽B、葫蘆巴堿對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成系列質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液，以進(jìn)樣濃度量（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)。
分別取桔梗皂苷D、黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.5、0.8、1.0、1.3、1.6mL置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，以進(jìn)樣量微克數(shù)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以桔梗皂苷D、黃芪甲苷色譜峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。
分別吸取對(duì)照品溶液10μL，在色譜條件“2.1”下，連續(xù)進(jìn)樣6次，黃芪甲苷、毛蕊異黃酮糖苷、芒柄花素、桔梗皂苷D、五味子醇甲、茯苓酸、太子參環(huán)肽B、葫蘆巴堿各標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時(shí)間RSD(n=6）≤0.90%，各峰面積的RSD(n=6）分別為2.17%、0.85%、0.77%、2.48%、0.92%、0.81%、0.64%、0.94%，結(jié)果表明儀器精密度良好。
分別取同一批健脾扶正顆粒（批號(hào)200614)6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下操作，在色譜條件“2.1”下測(cè)定，分別計(jì)算8個(gè)對(duì)照品黃芪甲苷、毛蕊異黃酮糖苷、芒柄花素、桔梗皂苷D、五味子醇甲、茯苓酸、太子參環(huán)肽B、葫蘆巴堿各標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時(shí)間RSD(n=6）≤0.33%，峰面積的RSD(n=6）分別為1.79%、2.42%、2.17%、2.98%、2.68%、2.40%、2.40%、2.71%，表明方法的重復(fù)性良好。
分別取同一批健脾扶正顆粒（批號(hào)200614)6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下操作，色譜條件“2.1”下測(cè)定，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24h，其中8個(gè)對(duì)照品黃芪甲苷、毛蕊異黃酮糖苷、芒柄花素、桔梗皂苷D、五味子醇甲、茯苓酸、太子參環(huán)肽B、葫蘆巴堿的各標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時(shí)間RSD(n=6）≤0.42%。
分別取已知含量的健脾扶正顆粒樣品（批號(hào)200614)6份，精密稱定，分別精密加入與樣品中成分含量接近的對(duì)照品黃芪甲苷、毛蕊異黃酮糖苷、芒柄花素、桔梗皂苷D、五味子醇甲、茯苓酸、太子參環(huán)肽B、葫蘆巴堿對(duì)照品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下操作，在色譜條件“2.1”下測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，計(jì)算得到平均回收率（n=6）分別為100.93%、95.93%、100.79%、104.59%、101.49%、96.26%、99.98%、100.45%。
RSD(n=6）分別為0.97%、1.44%、1.48%、1.01%、1.20%、1.20%、2.38%、2.15%。
分別取15批健脾扶正顆粒(S1～S15），按“2.2.2”項(xiàng)下操作，色譜條件“2.1”下測(cè)定，將測(cè)得的15批HPLC色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版），得到樣品指紋圖譜疊加圖。
對(duì)15批健脾扶正顆粒的指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，HPLC-UV結(jié)果范圍為0.996～0.999。
HPLC-ELSD結(jié)果范圍為0.948～0.999。
相似度均在0.90以上，說明健脾扶正顆粒質(zhì)量穩(wěn)定，化學(xué)成分一致性較好，但各成分含量存在差異。
分別為1號(hào)峰（葫蘆巴堿）、6號(hào)峰（毛蕊異黃酮糖苷）、14號(hào)峰（太子參環(huán)肽B）、16號(hào)峰（芒柄花素）、18號(hào)峰（五味子醇甲）、30號(hào)峰（茯苓酸）。
按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液，確認(rèn)了2個(gè)色譜峰，依次是32號(hào)峰（桔梗皂苷）、33號(hào)峰（黃芪甲苷）。
1號(hào)峰來自白扁豆，3、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、29號(hào)峰來自五味子，4、5、14、31號(hào)峰來自太子參，2、6、8、10、12、16號(hào)峰來自黃芪，7、9、11、30號(hào)峰來自茯苓。
其中13、15、17、23峰的藥材來源有待進(jìn)一步研究。
分別取15批健脾扶正顆粒樣品6g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下操作。
分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算8個(gè)成分的含量。
本研究分別以健脾扶正顆粒指紋圖譜中標(biāo)定的33個(gè)（包括蒸發(fā)光散射檢測(cè)的2個(gè)峰）進(jìn)行聚類分析，d=25時(shí)，15批樣品可以分為2類，即S1、S2、S3、S4、S5、S7、S9、S11、S13、S14被聚為第1類，其他被聚為第2類。
d=10時(shí)，后一類又可以聚為四類，即S6、S15聚為一類，S8、S10、S12聚為一類，S9、S14、S1、S7聚為一類，S5、S13、S11、S2、S4、S3聚為一類。
以各共有峰的相對(duì)峰面積為指標(biāo)，將15批健脾扶正33個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS26.0軟件進(jìn)行主成分分析，得到各成分碎石圖、主成分矩陣表計(jì)算其特征值和方差貢獻(xiàn)率，以特征值>1.5為標(biāo)準(zhǔn)，得到前4個(gè)主成分因子的特征值，其累積方差貢獻(xiàn)率為82.249%，前4個(gè)成分較陡，剩余的其他成分之間比較平緩。
選擇提取該4個(gè)主成分因子對(duì)15批健脾扶正顆粒樣品進(jìn)行評(píng)分，以方差貢獻(xiàn)率為分配系數(shù)，計(jì)算各批樣品的主成分因子得分及綜合得分，綜合得分越高表示樣品整體質(zhì)量越好，最后對(duì)綜合得分進(jìn)行排序。
本研究前期分別考察了不同波長(zhǎng)（203nm、210nm、230nm、250nm、280nm）、不同提取方法（加熱回流提取，超聲提?。?、不同提取溶劑（甲醇、80%甲醇、50%甲醇、水）、不同流動(dòng)相體系（乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水溶液）、不同柱溫（30℃、40℃）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)（203nm、210nm、250nm）切換、80%甲醇溶劑加熱回流提取、0.1%磷酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相、柱溫30℃的條件下提取的色譜峰信息較為豐富，有較好的色譜峰峰形，其中黃芪甲苷和桔梗皂苷不適用于在紫外下測(cè)定，故采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。
本研究建立的指紋圖譜，對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.90，共標(biāo)定了33個(gè)共有峰，其中指認(rèn)了8個(gè)色譜峰。
通過對(duì)15批健脾扶正顆粒進(jìn)行含量測(cè)定，顯示這15批樣品8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品黃芪甲苷、毛蕊異黃酮糖苷、芒柄花素、桔梗皂苷D、五味子醇甲、茯苓酸、太子參環(huán)肽B、葫蘆巴堿含量分別為0.26～0.30、0.07～0.08、0.27～0.35、0.15～0.17、0.40～0.50、0.27～0.34、0.17～0.22、0.23～0.32mg·g-1，表明健脾扶正顆粒制備工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控性良好。
近年來，研究人員通過指紋圖譜結(jié)合聚類分析和主成分分析，對(duì)中藥材制劑的質(zhì)量進(jìn)行更加全面的評(píng)價(jià)。
本實(shí)驗(yàn)以共有峰的相對(duì)峰面積為變量得到的結(jié)果顯示S1、S2、S3、S4、S5、S7、S9、S11、S13、S14被聚為1類，其他被聚為第2類，以S1樣品的綜合得分最高。
綜上所述，本研究建立的指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結(jié)果可為健脾扶正顆粒劑的質(zhì)量控制提供參考。
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